Lipáz enzimaktivtás mérése

1. Lipáz enzimaktivtás mérése

2. Lipidek • Vegyületek heterogén csoportja • Vízoldhatatlan • Organizmusokban általában fehérjékkel (lipoproteinek), szénhidrátokkal (liposzaharidok) képzett vegyületei fordulnak elő • A lipidek nagy része triglicerid formájában kerül a talajba • A lebontás első lépését a lipáz (triglicerid-acilhidroláz) enzim végzi • A reakció során zsírsavak és glicerin szabadul fel

3. Zsírsavak • Hosszú szénláncú karbonsavak • Lehetnek telített-, telítetlen-, keto-, hidroxi-, epoxi-, elágazó szénláncú, vagy gyűrűs, savak. • A leggyakoribbak a telítetlen zsírsavak cisz izomerjei

4. Zsírsavak bontása • Aerob környezetben • β-oxidáció: 2 szénatomos darabok lehasadásával bomlanak, melynek végterméke CO2 és víz • Ritkább esetben α-, vagy σ-oxidáció megy végbe. Ez esetben az oxidáció nem teljes • Anaerob környezetben a zsírsavak feldúsulnak a környezetben

5. Az enzimaktivitás mérésének kivitelezése

6. Az eljárás alapelve • A talajt 4-metil-umbelliferon-heptanoáttal (4- MUH) inkubáljuk 10 percen át 30°C-on. • A talaj lipáz aktivitására a felszabaduló, fluoreszcens 4-metil-umbelliferon (4-MU) mennyiségéből következtethetünk. • Szükséges anyagok és felszerelések: • Fluoriméter • Rázó vízfürdő • Centrifuga, centrifuga csövek (10 ml) • Erlenmeyer lombikok (25 ml)

7. Szükséges vegyületek, oldatok • Etilén-glikol-monometil-éter • 4-MUH (10mM) • Oldjunk fel 58 mg 4-MUH-t 10 ml etilén-glikol-monometil-éterben, majd töltsük fel ugyanezzel az oldószerrel 20 ml-re (tárolás -20°C-on). Az oldatot naponta készítsük el! • TRIS (2-amino-2-hidroximetil-propán-1,3-diol) puffer (0,1 M, pH 7,5) • 12,11 g TRIS-t oldjunk fel 700 ml desztillált vízben, 0,1M sósavval állítsuk a pH-t 7,5-re, majd töltsük fel 1000 ml-ig desztillált vízzel • 4-MU standard oldat • 176 mg MU-t feloldunk 70 ml etilén-glikol-monometil-éterben, , majd feltöltjük ugyanezzel az oldószerrel 100 ml-re. Az oldat 4 °C-on több napig eláll.

8. Az eljárás • Helyezzünk 0,1 g nedves talajmintát 25 ml-es Erlenmeyer lombikba, adjunk hozzá 4,5 ml TRIS puffert, zárjuk le és inkubáljuk 30°C-on rázó vízfürdőben 10 percig • Adjunk hozzá 0,5 ml 4-MUH szubsztrátot, rázzuk jól össze, zárjuk le és ismét inkubáljuk 30°C-on rázó vízfürdőben 10 percig • Ezután jeges vízbe helyezve a lombikot, hűtsük le a mintákat • Kontroll minta készítéséhez adjuk a szubsztrátodatota talaj szuszpenzióhoz amint a lombikot hűteni kezdjük • Ezután 2°C-on 4000 g-n centrifugáljuk a mintákat • Spektrofluorimetriával vizsgáljuk a felülúszóban a felszabadult 4-MU mennyiségét (gerjesztési hullámhossz: 340 nm, emissziós hullámhossz: 450 nm)

9. Kalibrációs görbe • Hígítsuk a desztillált vízzel a 4-MU standard oldatot (1:100) • Helyezzünk 0,1 g talajmintát Erlenmeyer lombikba és adjunk hozzá 4,5 ml TRIS puffert, illetve 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 és 0,5 ml 4-MU standard oldatot • Adjunk 0,5; 0,4; 0,3; 0,2; 0,1 és 0 ml desztillált vizet az oldatokhoz, hogy kiegészítsük 5 ml-re • Folytassuk „Az eljárás” dián leírtak szerint • A standardekkoncenjtrációja 0, 10, 20, 30, 40, 50 nM • A kalibrációs görbét minden talajmintához külön kell elkészíteni

10. Számítás • Korrigáljuk az eredményeket a kontroll minta alapján • Számítsuk az enzimiaktivtást a a következő képlet alapján:Ahol U az enzimaktivitás (nM×g-1×dwt-1×10 min-1), MU a mért 4-MU koncentráció nmol/l-ben, dwt a 1 g talajminta száraz tömege, 0,1 a felhasznált talajminta száraz tömege.

11. Forrás • Alef, K.; Nanniperi, P.: Methods in Applied Soli Microbiology and Biochemistry, 1995