ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

1. ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΚΑΙ ΕΚΚΡΙΣΗΣ sPLA2-IIA ΣΕ ΠΝΕΥΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΑ ΤΥΠΟΥ II ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΠΙΔΡΑΣΗ LPS ΚΑΡΑΓΙΑΝΝΟΠΟΥΛΟΣΜΙΧΑΛΗΣ Χημικός, Μεταπτυχιακός Φοιτητής Βιοχημείας και Κλινικής Χημείας

2. ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΚΑΙ ΕΚΚΡΙΣΗΣ sPLA2-IIA ΣΕ ΠΝΕΥΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΑ ΤΥΠΟΥ II ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΠΙΔΡΑΣΗ LPS ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ • Ορισμός και μοντέλα σήψης, Κυτοκίνες στη σήψη • Μοντέλα έκκρισης -Φωσφολιπάση Α2 • Εργαστηριακές τεχνικές ανίχνευσης και προσδιορισμού sPLA2-IIA

3. SIRS ΣΗΨΗ ΛΟΙΜΩΞΗ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ Σύνδρομο Συστημικής Φλεγμονώδους Απόκρισης (SIRS): Είναι μια συστημική φλεγμονώδης απόκριση σε ποικιλία σοβαρών κλινικών βλαβών (π.χ. οξεία παγκρεατίτιδα, πολλαπλούν τραύμα, εισρόφηση, έγκαυμα). Λοίμωξη: Είναι μια φλεγμονώδης απόκριση, που οφείλεται στην παρουσία κάποιου μικροοργανισμού. ΣΗΨΗ:Πολύπλοκο κλινικό σύνδρομο που χαρακτηρίζεται από συστημική φλεγμονώδη απόκριση (SIRS) σε συνδυασμό με τοπική ή συστημική λοίμωξη.

4. ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ Μοντέλο σήψης:LPS • Βακτηριακός Λιποπολυσακχαρίτης. • Βρίσκεται σε αφθονία στο εξωτερικό περίβλημα των αρνητικών κατά Gram βακτηρίων. Πηγή: Microbiology, Gary E. Kaiser • Λιπίδιο Α: Φωσφολιπίδιο που προκαλεί την παραγωγή φλεγμονωδών μεσολαβητών. Αποτελεί το ενεργό τμήμα του LPS. • Εσωτερικός πυρήνας ολιγοσακχαρίτη: Συνδέεται με το Λιπίδιο Α και λαμβάνει μέρος στην ανάπτυξη αντίστασης σε υδρόφοβα αντιμικροβιακά πεπτίδια. • Εξωτερική περιοχή Ο-πολυσακχαρίτη (αντιγόνου-Ο): Είναι η εξωτερική περιοχή του LPS και αποτελεί την αντιγονική περιοχή-στόχο των ανοσολογικών αποκρίσεων των ξενιστών.

5. Πηγή: Jpherveg ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ • Έναρξη σύνθεσης κυτοκινών • Σύνδεση LPS με LBP(Lipopolysaccharide-Binding Protein). • Σχηματισμός συμπλέγματος LPS-LBP. • Σύνδεση με το μόριο του υποδοχέα CD14. • Σύνδεση με την πρωτεΐνη MD2 και τον υποδοχέα TLR4.

6. ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ Παραγωγή κυτοκινών • Βιοσύνθεση TNF (Tumor Necrosis Factor) • Αρχίζει η σύνθεση του TNF από την μεταγραφή του γονιδίου TNF και από τη μετάφραση του TNFmRNA. • Φάση του καταρράκτη στη σήψη • Με την έκκριση του TNF ενεργοποιείται η έκκριση δευτεροπαθών μεσολαβητών π.χ. IL-1, IL-6, IL-8. Πηγή: Invivogen

7. ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ • Το κλειδί στη σήψη είναι οι κυτοκίνες, που είναι ανοσορρυθμιστικά πεπτίδια παραγόμενα από τον ξενιστή. • Κυτοκίνες: • Φλεγμονώδεις: TNFa, Φωσφολιπάση Α2, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-8, IL-15, IFN-γ, πρωτεινική κινάση, CD14, κ.λ.π • Αντι-φλεγμονώδεις: IL-1a, IL-4, IL-10, IL-13, ο υποδοχέας της IL-1 τύπου ΙΙ, κ.λ.π.

8. ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΚΑΙ ΕΚΚΡΙΣΗΣ sPLA2-IIA ΣΕ ΠΝΕΥΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΑ ΤΥΠΟΥ II ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΠΙΔΡΑΣΗ LPS ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ • Ορισμός και μοντέλα σήψης, Κυτοκίνες στη σήψη • Μοντέλα έκκρισης -Φωσφολιπάση Α2 • Εργαστηριακές τεχνικές ανίχνευσης και προσδιορισμού sPLA2-IIA

9. Cis-Golgi network SNARE pair COPI vesicle COPII vesicle Coat protein 1 SNARE protein SNARE pair Rough ER Soluble cargo Membrane receptor Membrane cargo ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ Εκκριτικά Μονοπάτια Πηγή: Molecular Cell Biology, Darnell

10. Ιδιοσύστατη Οδός Εξωκύτωσης (Constitutive Secretory Pathway): Κυστίδια μεταφοράς εκβλασταίνουν διαρκώς από το δίκτυο trans-Golgi και συντήκονται με την κυτταρική μεμβράνη. Ρυθμιζόμενη Οδός Εξωκύτωσης (Regulated Secretory Pathway): Μόρια αποθηκευμένα σε εκκριτικά κυστίδια απελευθερώνονται από το κύτταρο μετά από κατάλληλοερέθισμα. ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ Τελευταίο στάδιο της εκκριτικής πορείας: Εξωκύτωση Πηγή: Molecular Biology of the Cell, Alberts • Ορμόνες, Νευροδιαβιβαστές, Πεπτικά ένζυμα

11. ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ Φωσφολιπάση Α2:

12. ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ • Με βάση τις βιολογικές ιδιότητες και την τοπολογία, κατανέμονται σε: • Εκκρινόμενες φωσφολιπάσες Α2 (secretory phospholipases,sPLA2), • Κυτοσολικές φωσφολιπάσες Α2 εξαρτώμενες από ιόντα ασβεστίου (cytosolic phospholipases,cPLA2), • Ενδοκυττάριες ανεξάρτητες ιόντων ασβεστίου (intracellular phospholipases,iPLA2), • PAF- ακετυλυδρολάσες (PAF-acetylhydrolases,PAF-AcH).

13. ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ Εκκρινόμενη Φωσφολιπάση Α2 (Secretory Phospholipase A2-sPLA2): • Είναι μικρές, υδατοδιαλυτές πρωτεΐνες μεγέθους 13-18 kDα, αποτελούμενες από μία πολυπεπτιδική αλυσίδα που περιέχει 5-8 δισουλφιδικούς δεσμούς. • Τριτοταγή δομή, ηοποία παρέχει στα ένζυμα αυτά σταθερότητα κατά της πρωτεόλυσης και αντίστασηστη μετουσίωση. • Λαμβάνουν μέρος σε μια πληθώρα παθολογικών διαδικασιώνμέσω απελευθέρωσης αραχιδονικού οξέος οδηγώντας έτσι στην παραγωγή φλεγμονωδών λιπιδικών μεσολαβητών όπωςπροσταγλανδίνες, θρομβοξάνια και λευκοτριένια.

14. ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΕΚΚΡΙΝΟΜΕΝΩΝ ΦΩΣΦΟΛΙΠΑΣΩΝ Α2

15. ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ sPLA2-IIA • Ένζυμο εξαρτώμενο από ιόντα Ca2+. • Η αλληλουχία αμινοξέων της ανθρώπινης πρωτεΐνης αποτελείται από 124 αμινοξέα. • Έχει εμπλακεί σε φλεγμονώδεις νόσους, σηπτική καταπληξία και Σύνδρομο Οξείας Αναπνευστικής Δυσχέρειας ενηλίκων (ARDS). • Τα επίπεδα της sPLA2-IIA που ανιχνεύθηκαν σε BAL Fluid ή κύτταρα θεωρήθηκαν ως δείκτης για τη διάσπαση του επιφανειοδραστικού παράγοντα και συσχέτιση με την εν εξελίξει φλεγμονή.

16. ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΚΑΙ ΕΚΚΡΙΣΗΣ sPLA2-IIA ΣΕ ΠΝΕΥΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΑ ΤΥΠΟΥ II ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΠΙΔΡΑΣΗ LPS ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ • Ορισμός και μοντέλα σήψης, Κυτοκίνες στη σήψη • Μοντέλα έκκρισης -Φωσφολιπάση Α2 • Εργαστηριακές τεχνικές ανίχνευσης και προσδιορισμού sPLA2-IIA

17. Βακτηριοστατικό φίλτρο • 2000 rpm, 10 min • Lysis Buffer • 2000 rpm,10 min ΜΕΤΡΗΣΗ ΚΥΤΤΑΡΩΝ 1x106 cells/ τρυβλίο BAL ΚΥΤΤΑΡΑ Μετά από 4 h. BAL FLUID • Έλεγχος Προσκόλλησης • Προσθήκη Ενεργοποιητών / Αναστολέων LPS • Πρωτεΐνη(Bradford) • SDS-PAGE • 2-DElectrophoresis • sPLA2-IIA (Western Blotting) • Confocal Microscopy Συλλογή μεscrapper ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ Απομόνωση και επεξεργασία του BAL για εργαστηριακές αναλύσεις

18. Πηγή: Bioinformatics ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ Sodium Dodecyl Sulfate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis: SDS-PAGE Η μετακίνηση των συμπλόκων SDS-πολυπεπτιδίων εξαρτάται μόνο από το μέγεθός τους και επιτυγχάνεται με την εφαρμογή ηλεκτρικού ρεύματος μεταξύ των ηλεκτροδίων. Πηγή: Bioinformatics

19. ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ Ανοσοαποτύπωση πρωτεϊνών –Western Blotting Πηγή: Bio-Rad Laboratories Πηγή: GenScript Μέθοδος μεταφοράς πρωτεϊνών από gel σε μεμβράνη PVDF για την ανίχνευση της παρουσίας,σχετικής ποσότητας και μοριακού βάρους μιας συγκεκριμένης πρωτεΐνης. Για την ανίχνευσημιας συγκεκριμένης πρωτεΐνης, είναι απαραίτητη η χρήση ανοσοχημικών μεθόδων.

20. Πηγή: GE Healthcare ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ Ηλεκτροφόρηση Διπλής Διάστασης – Two Dimensional Electrophoresis (2-DE) Πηγή: Mollecular and cellural proteomics Πηγή: Arabidopsis seed proteome 1η Διάσταση ΙΣΟΗΛΕΚΤΡΙΚΟ ΣΗΜΕΙΟ 2η Διάσταση ΜΟΡΙΑΚΟ ΒΑΡΟΣ Χρώση του gel • Coomassie blue G-250 • Colloidal Coomassie • Silver Nitrate IPG strips SDS-PAGE

21. ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ Συνεστιακή ΜικροσκοπίαΣάρωσης Laser - Confocal Laser Scanning Microscopy Πηγή: Δίκτυο Οριζόντιων Εργαστηρίων Πανεπιστημίου Ιωαννίνων • Παράγει με τη μορφή κηλίδων, ξεκάθαρες εικόνες σε αδιαπέραστα από την όραση δείγματα, σε ποικίλα επίπεδα. • Και ο φωτισμός και η παρατήρηση είναι περιορισμένα σε ένα σημείο του παρασκευάσματος. • Πραγματοποιείται ανίχνευση και στις τρεις διαστάσεις x, y, z.

22. Department of Chemistry Ευχαριστώ για την προσοχή σας!