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突变体 P53-Y200C 小分子激活剂的虚拟筛选和验证

突变体 P53-Y200C 小分子激活剂的虚拟筛选和验证. 报告人：丁吉勇 导 师：刘夫锋 时 间： 2013.09.17. 报告内容. 研究背景及现状 研究内容 研究 特色 与创新之处. 研究背景. 在正常的细胞内，当 p53 功能正常时，能够激活 DNA 修复机制并防止损伤的 DNA 分裂。当 DNA 损伤不能修复， P53 将诱导细胞凋亡或程序性细胞死亡。所以 P53 发生突变，不能行使其正常功能时，就会导致癌症的发生。. Figure. 1 The function of P53:cell cycle arrest.

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突变体 P53-Y200C 小分子激活剂的虚拟筛选和验证

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Presentation Transcript

  1. 突变体P53-Y200C小分子激活剂的虚拟筛选和验证 报告人：丁吉勇 导 师：刘夫锋 时 间：2013.09.17

  2. 报告内容 • 研究背景及现状 • 研究内容 • 研究特色与创新之处

  3. 研究背景 在正常的细胞内，当p53功能正常时，能够激活DNA修复机制并防止损伤的DNA分裂。当DNA损伤不能修复，P53将诱导细胞凋亡或程序性细胞死亡。所以P53发生突变，不能行使其正常功能时，就会导致癌症的发生。 Figure. 1 The function of P53:cell cycle arrest Joerger A C, Fersht A R. Rev. Biochem., 2008, 77: 557-582.

  4. 约有50%的人类癌症是由于肿瘤抑制物P53的突变而导致的失活引起的， P53失活导致癌症的机理主要有两种： 1、突变导致无法与DNA结合 2、突变导致稳定性下降 Figure.2 Structure of the p53 core domain bound to consensus DNA .Cancer mutation sites are shown in orange. Joerger A C, Fersht A R. Oncogene, 2007, 26(15): 2226-2242.

  5. 研究背景 Figure.3 The relative frequency of cancer-associated mutations for each residue according to the TP53 mutation database of the International Agency for Research on Cancer (www-p53.iarc.fr). 由上图可知，大多数突变发生在P53的核心结构域（94-292）， Y220C是除DNA结合表面之外频率最高的致癌错义突变，占P53错义突变的1.4％，每年全球由于Y220C突变产生的新的癌症病例约有75000个，因此，针对这个突变体设计药物是必要的。

  6. 研究背景 Y220C突变如何导致P53失活？ Y220C突变体由第220位的酪氨酸突变成了半胱氨酸，该突变是在热力学上是高度不稳定的。但T-p53C-Y220C的晶体结构显示，Y220C突变体保持了核心结构域的结构完整性。 核心结构域降低了4kcal/mol的稳定性 Tm值由原先的44℃降低到43℃ Joerger A C, Ang H C, Veprintsev D B, et al. Journal of Biological Chemistry, 2005, 280(16): 16030-16037.

  7. 研究背景 Y220C突变如何导致P53失活？ 四个核心结构域以协同方式结合这些DNA反应元件，得到P53蛋白：DNA反应元件为4:1的复合物，四聚体与单体之间存在一个可逆的平衡，四聚体单体，而Y220C突变导致单体蛋白展开，使平衡向右移动，从而减少了四聚体的数量，导致P53无法行使其正常功能。 Figure.4 T-P53 core domain tetramer bound to DNA. Joerger A C, Fersht A R. Cold Spring Harbor perspectives in biology, 2010, 2(6).

  8. 研究现状 在Y220C突变体中的分子表面，具有一个由于突变引起的比较大的缝隙，这个缝隙连接了两个p53C中原本存在的小的缝隙，由于这个缝隙远离与DNA识别或蛋白相互作用表面的区域，使其成为小分子药物非常合适的靶位点。 Y220 C220 Figure.5 Molecular surface of T-p53C around Tyr-220 and T-p53C-Y220C around Cys-220 , showing the mutation-induced crevice (PDB ID code 2J1X, molecule A). JoergerA C, Fersht A R. Oncogene, 2007, 26(15): 2226-2242.

  9. 研究现状 通过分子对接筛选出一个结合到突变体Y200C表面缝隙的分子家族，挑选其中具有代表性的分子做核磁共振光谱分析，发现咔唑衍生物PhiKan083提高了突变体的热稳定性，实验显示与PhiKan083结合后Y200C的Tm值提高了2℃，并且降低了热变性的速度。 Figure.6 Molecular surface of the p53 mutant Y220C bound to the carbazole derivative PhiKan083. Boeckler FM, Joerger AC, Jaggi G, Rutherford TJ, Veprintsev DB, Fersht AR. 2008. ProcNatlAcadSci 105: 10360–10365.

  10. 研究现状 通过分子动力学模拟，结合量子化学计算，研究了Tp53C-Y220C的动力学和原子间的相互作用力。阐述了Y220C突变对结构稳定性的影响以及在原子水平PhiKan083恢复蛋白稳定性的机制。 Figure.7 Details interaction of Cys220 and Phikan083 with surrounding residues in Y220C-Tp53C-Phikan083 obtained from UA-QCMD calculation. RaufS M A, Endou A, Takaba H, et al. The protein journal, 2013, 32(1): 68-74.

  11. 研究内容 分子对接 分析小分子与蛋白之间的作用力 分子动力学模拟 N Y 选取类似结构的分子验证，总结结合效果好的分子间的共同特点 选取数据库中其他小分子 实验验证 从数据库中挑选其他类型的小分子 N

  12. 研究内容 1.利用分子对接筛选能与Y220C突变体结合的小分子 •小分子数据库：drugbank、中草药小分子库 •小分子初筛条件： Drugbank：分子量<300，ClogP≤3，hydrogen bond donors ≤3， hydrogen bond acceptors≤3 中草药小分子库：分子量<600，ClogP≤5， hydrogen bond donors≤5， hydrogenbondacceptors ≤10 •受体蛋白：P53-Y220C（PDB ID： 2J1X） •软件：autodock vina TrottO, Olson A J. Journal of computational chemistry, 2010, 31(2): 455-461. Knox C, Law V, JewisonT.WishartDS. Nucleic Acids Res. 2011 Jan;39(Database issue):D1035-41. 

  13. 研究内容 Figure.8Histogram of best docking scores for compounds from drugbank against P53-Y220C.

  14. 研究内容 Figure.9 Histogram of best docking scores for herb small moleculars against P53C-Y220C.

  15. 研究内容 分子对接结果-drugbank 名称：Anagrelide 化学式：C10H7Cl2N3O 分子量：256.008 亲和力：-5.6 kcal/mol 名称：Proguanil 化学式：C11H16ClN5 分子量： 253.731 亲和力：-5.3 kcal/mol

  16. Table1. Ranking order of the small molecules virtual screened.

  17. 2.分子动力学模拟 3.P53突变体的表达与纯化 用GROMACS MD模拟软件，对小分子与蛋白的结合过程进行模拟，评估筛选出的小分子结合到p53-Y220C后对其结构的影响，并分析结合作用力。 合成P53突变体基因，构建重组表达质粒，导入到大肠杆菌中进行表达。将表达后的突变体进行分离纯化。 4.实验验证 利用等温滴定量热法（ITC）检测P53-Y220C与小分子化合物结合后的能量变化，获得结合过程中的完整热力学参数，验证小分子结合蛋白后对蛋白稳定性的影响。

  18. 研究特色与创新点 1.本研究中使用的小分子数据库Drugbank是目前最大的药物数据库，其中收录的小分子药物是FDA批准或者正在审批中的已知药物，不仅有很强的成药性，而且各种物理化学、药物、生理性质都很清楚，非常适合用于虚拟筛选。构建的中草药数据库在五规则的基础上计算了分子极性表面积，类药性参数较高。 2.结合ITC和分子动力学模拟分析小分子与突变体之间形成的作用力，以及这些作用力对蛋白稳定性的影响，指导进一步的研究。

  19. 参考文献： [1]JoergerA C, Fersht A R. Structural biology of the tumor suppressor p53[J]. Annu. Rev. Biochem., 2008, 77: 557-582. [2]JoergerA C, Fersht A R. Structure–function–rescue: the diverse nature of common p53 cancer mutants[J]. Oncogene, 2007, 26(15): 2226-2242. [3]JoergerA C, Ang H C, Veprintsev D B, et al. Structures of p53 cancer mutants and mechanism of rescue by second-site suppressor mutations[J]. Journal of Biological Chemistry, 2005, 280(16): 16030-16037. [4]JoergerA C, Fersht A R. The tumor suppressor p53: from structures to drug discovery[J]. Cold Spring Harbor perspectives in biology, 2010, 2(6). [5]BoecklerFM, Joerger AC, Jaggi G, Rutherford TJ, VeprintsevDB, Fersht AR. 2008. Targeted rescue of a destabilized mutant of p53 by an in silico screened drug. ProcNatlAcadSci 105: 10360–10365. [6]RaufS M A, Endou A, Takaba H, et al. Effect of Y220C Mutation on p53 and Its Rescue Mechanism: A Computer Chemistry Approach[J]. The protein journal, 2013, 32(1): 68-74.

  20. [7]WassmanC D, Baronio R, Demir Ö, et al. Computational identification of a transiently open L1/S3 pocket for reactivation of mutant p53[J]. Nature communications, 2013, 4: 1407. [8] Knox C, Law V, Jewison T, Liu P, Ly S, Frolkis A, Pon A, Banco K, Mak C, Neveu V, Djoumbou Y, Eisner R, Guo AC, Wishart DS. DrugBank3.0: a comprehensive resource for 'omics' research on drugs. Nucleic Acids Res. 2011 Jan;39(Database issue):D1035-41.  [9]TrottO, Olson A J. AutoDockVina: improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization, and multithreading[J]. Journal of computational chemistry, 2010, 31(2): 455-461.

  21. Thank you !

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