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生物化学与分子生物学实验技术

生物化学与分子生物学实验技术. 江 红 北京交通大学生命科学与生物工程研究院. Email: jhong@bjtu.edu.cn Tel: 51688577-609(O); 13141454106 Skype: jhmqfmxd. 安全第一、实验第二. 1. 装备：实验服，手套，防护镜，面具. 2. 设备：电源，灭火器，高压锅，液氮罐，低温冰箱. 3. 食物：禁烟，禁食，禁饮. 4. 仪器：使用须知 / 说明书. 5. 试剂：酸缸，试剂柜，试剂签字领用.

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生物化学与分子生物学实验技术

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  1. 生物化学与分子生物学实验技术 江 红 北京交通大学生命科学与生物工程研究院 Email: jhong@bjtu.edu.cn Tel: 51688577-609(O); 13141454106 Skype: jhmqfmxd

  2. 安全第一、实验第二 1. 装备：实验服，手套，防护镜，面具 2. 设备：电源，灭火器，高压锅，液氮罐，低温冰箱 3. 食物：禁烟，禁食，禁饮 4. 仪器：使用须知/说明书 5. 试剂：酸缸，试剂柜，试剂签字领用 http://bbs.bioon.net/bbs/thread-376066-1-1.html#from=bioonright

  3. 课程安排 1.分子生物学常用技术，8h(0908/8:00, 0915/8:00) 2.实验：16h (0922----1014) A-T克隆，重组蛋白在细菌中的诱导表达，WB 3.实例分析分子生物学技术的应用，4h(1020/8:00) 4.讨论课，4h(1027/8:00) 5.考试，2h(1101/10:00)

  4. 实验：每人任选一个实验 成绩：70%：考试 15%：课后思考题，打印版，1024之前交 10%：实验操作 5%：考勤 考试：时间: 1101/10:00 形式：限时开卷， 内容：讲课+实验结果分析+实验设计

  5. 分子生物学常用技术

  6. 昆虫表达载体 病毒表达载体 真核表达载体 原核表达载体 酵母表达载体 PCR产物 A-T克隆 测序 重组表达载体 制备抗体 检测活性 转 染 细 胞 重 组 蛋 白 体内、体外 作用机制 应用

  7. 步骤： (1)PCR (2)核酸的纯化：凝胶回收Kit (3)连接反应：16℃过夜/22 ℃ 2h (4)CaCl2法制备感受态细胞：Kit (5)转化：宿主菌，蓝白筛选 (6)挑克隆：2ml 含抗生素的LB (7)提质粒：Kit (8)重组质粒的鉴定：双酶切反应、菌落PCR (9)测序：生物技术服务公司 (10)菌种保存: 20~30%甘油-LB，-20/-70 ℃

  8. (11)外源基因在哺乳动物细胞中的表达：质粒转染、电转染(11)外源基因在哺乳动物细胞中的表达：质粒转染、电转染 (12)目的基因表达的鉴定：RT-PCR、Northern Blot、 原位杂交、Southern Blot (13)目的蛋白表达的检测： 原核表达：SDS-PAGE (重组蛋白诱导表达的诱导剂浓度、 诱导时间和温度、重组蛋白表达的形式)、WB 真核表达：Western Blot、ELISA、免疫组化

  9. (14)重组蛋白的纯化：亲和层析，His-tag/GST-tag (15)制备抗体：多抗和单抗 (16)基因功能检测：提高/降低表达水平 细胞周期检测：流式细胞仪 细胞增殖检测：MTT 细胞凋亡检测: 流式细胞仪、TUNEL、DNA Ladder 抑瘤活性检测：体外、体内 对血管化的影响 。。。。。。。 (17)作用机制

  10. 实验一：A-T克隆 1. PCR：Pfu, 加A尾；[0922/8:00/a ] 2. Agarose电泳：Gelred染色;[0922/b ] 3. 核酸纯化：凝胶回收Kit; [0922/c ] 4. Agarose电泳：检测回收条带; [0922/b] 4. 连接反应：pGMT, 4℃过夜; [0922/d ] 5. 转化：Top10, 热激法，蓝白筛选。[0923/8:00/e ]

  11. 实验二：A-T克隆 1. 挑克隆：2ml 含抗生素的LB + 1个克隆；[0928/8:00/f ] 2. 提质粒：Kit；[0929/8:00/g ] 3. 重组质粒的鉴定：双酶切反应， 37 ℃ 2h；[0929/h ] 4. Agarose电泳：Goldview染色；[0930/8:00/b] 5. 测序和序列比对：生物技术服务公司； [0930/h] 6. 菌种保存：20~30%甘油-LB，-20/-70 ℃。 [0930/h]

  12. 实验三：重组蛋白在细菌中的诱导表达 转化：BL21, 热激法；[0928/8:00/i] 挑克隆： 2ml 含抗生素的LB + 1个克隆；[0929/8:00/f] 转接：1%过夜菌+ 2ml 含抗生素的LB , 2管; [0930/8:00/j ] 诱导：0.5mM和0.1mM的IPTG（终浓度）; [0930/j] 碎菌：超声处理; [1012/8:00/k ] SDS-PAGE：10%分离胶，考兰染色，脱色。[1013/ 8:00/l ]

  13. 实验四：Western-blot SDS-PAGE：10%分离胶；[1013/ 8:00/m ] 转膜：湿转；[1013/n ] 封闭：RT 1h；[1013/o ] Ab1：4 ℃过夜 ；[1013/o] Ab2：RT 40min ；[1014/8:00/p ] ECL：RT 5min ；[1014/p]

  14. 实验 XXX 原理 设备：加样器 耗材 试剂和配制方法：详细 步骤：详细 注意事项 问题及分析 1020交打印版

  15. 内容 1. 核酸的分离纯化和鉴定：基因组DNA、总RNA、质粒 2. 基因的克隆与鉴定方法 3. 外源基因转移技术和表达体系 4. 检测方法：电泳技术：agarose、SDS-PAGE 分子杂交：SB、NB、WB、基因芯片技术 DNA序列测定 生物信息学分析技术 5. 基因功能研究的方法 6. 组学研究技术：基因组学、蛋白质组学

  16. ’ 核酸的基本组成

  17. “其对蛋白质，包括核物质的研究工作为我们了解细胞化学作出了贡献”“其对蛋白质，包括核物质的研究工作为我们了解细胞化学作出了贡献” 揭示核酸的化学成分 Albrecht Kossel 1910年诺贝尔生理或医学奖

  18. “核苷和核苷辅酶” 核苷酸的基本结构 Lord (Alexander R.) Todd 1957年诺贝尔化学奖

  19. “发现核酸的分子结构及其对于生命物质信息传递的重要意义”“发现核酸的分子结构及其对于生命物质信息传递的重要意义” Maurice Hugh Frederick Wilkins Francis Harry Compton Crick James Dewey Watson DNA分子的二级结构 1962年诺贝尔生理或医学奖

  20. 5’末端 (游离磷酸基) 3’末端 (游离羟基) 特点 数量庞大 dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 3’，5’-磷酸二酯键(共价键) 直线形多聚体 方向: 5’---3’ ，5’ CAG….. 3’

  21. DNA半保留复制

  22. 变性与复性 变性：指核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链， 不涉及共价键断裂，不引起分子量降低。

  23. 一、核酸的分离、纯化和鉴定 • 基因组DNA的分离、纯化： • PCR、Southern- blot、构建基因组文库 • 实验材料：哺乳动物组织(50~100mg，绿豆大小) • 哺乳动物细胞(5x105~107) 六孔板/T25

  24. 实验步骤：RT 匀浆：TE pH8.0 组织( 液氮冻存、研磨) 消化：EDTA 、SDS、蛋白酶K、RNase、37℃/55 ℃ 抽提：酚、氯仿、异戊醇 沉淀：异丙醇 / NaAc + 无水乙醇 洗涤：75％乙醇 干燥：风干 溶解：TE / H2O

  25. 注意事项： (1) 试剂：pH值准确 (2) 蛋白酶K：20mg/ml， 分装，-20℃，避免反复冻融 (3) 抽提：完全，不要触及蛋白层 (4) 干燥：避免过分 (5) 操作：小心，机械剪切作用，80~100kb 2. 总RNA的分离纯化：略

  26. 3. 质粒：细菌等微生物细胞染色体以外， 能独立进行复制和遗传， 赋予宿主细胞一定生物学性状的共价闭环双链DNA分子。

  27. 合格质粒的组成要素 复制起始位点：原核1个，真核多个 抗性基因 多克隆位点 启动子 增强子 终止信号 加polyA信号

  28. 如何阅读质粒？ 第一步：质粒类型：Ori位置，原核/真核/穿梭质粒； 第二步：筛选标记：如抗性，决定使用什么筛选标记：（1）Ampr：水解β-内酰胺环，解除氨苄的毒性。（2）tetr：可以阻止四环素进入细胞。 （3）camr：生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。（4）neor：氨基糖苷磷酸转移酶 使G418（长那霉素衍生物）失活。（5）hygr：使潮霉素β失活。 第三步：多克隆位点，内切酶位点 第四步：外源基因插入片段大小，＜10kb， 大选大小找小 第五步：表达系统元件：启动子 - 核糖体结合位点 - 克隆位点 - 转录终止信号。 克隆载体/表达载体

  29. 收菌 重悬：T E-葡萄糖 裂解：变性，NaOH-SDS 5min 中和：复性，KAc 抽提：酚:氯仿:异戊醇(25:24:1) 沉淀：异丙醇 洗涤：70％乙醇 溶解：TE-RNase A 碱裂解法

  30. Kit: DNA介质(硅胶、玻璃奶) 纯化： 氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心 聚乙二醇分级沉淀法

  31. 4、核酸纯度的鉴定 OD260：DNA, RNA; OD280：蛋白质 浓度：1OD260：50μg/ml 双链 DNA 40μg/ml 单链 DNA，总RNA 35μg/ml 单链RNA 20μg/ml 单链寡核苷酸 纯度：OD260 / OD280 ：蛋白质污染程度，DNA 1.8，RNA 1.7~2.1 OD260 / OD230：碳水化合物污染程度，2.0 OD260和OD280应大于0.05

  32. 二、基因的克隆与鉴定方法 • 基因的化学合成 • 目的基因的克隆策略 • (1) 根据已知碱基或氨基酸序列克隆基因 • (2) 根据表型变异克隆基因 • (3) 基于图谱的基因克隆方法 • 3. 文库的构建与目的基因的克隆 • 4. PCR反应与目的基因的克隆 • 5. 目的基因克隆的鉴别与分析

  33. 基因的化学合成 • 前提条件：已知基因的核苷酸序列或蛋白质的氨基酸序列 • 适用：分子量较小、价值极高的目的基因 • 历史：1979年， Khorana等首次合成E coli酪氨酸tRNA基因 • 方法：磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法 • 方式：固相合成法和自动合成法

  34. 2. 目的基因的克隆策略 (1)根据已知碱基或氨基酸序列克隆基因 a.一个基因的序列已知：PCR技术，目的DNA片段 b.一个基因的一段碱基序列已知： 反向PCR/RACE，cDNA全长； 探针：筛选cDNA文库，cDNA全长 c.一个或多个物种的某种基因序列已知：同源性比较， 保守序列，探针/引物，文库筛选/PCR，从新物种中 分离功能相似的基因 d.已知蛋白质的氨基酸序列：密码子的兼并性，可能的 核苷酸序列，探针，筛选基因组/cDNA文库，基因序列

  35. 转座子DNA 隐性纯合亲本 显性目的基因的纯合亲本 F1：理论上全部为目的基因编码的显性特征 筛选因转座子插入而表现出隐性性状的个体 构建基因组文库 构建基因组文库 探针：转座子DNA 筛选 带有目的基因的阳性克隆 编码显性特征的目的基因 转座子两侧的目的基因序列 (2)根据表型变异克隆基因：未知序列基因的克隆 ＃转座子示踪技术：又称转座子标签法，酵母和植物

  36. ＃mRNA 差异显示： DD-PCR，1992，只能分离与某种 处理或特征有关的基因 步骤： a.提总RNA: 具有对比意义的两组，注意痕量DNA的污染 b.反转录：得到细胞内所有基因的cDNA库 下游引物：12组，T12MN(M:A、C、G; N:A、C、G、T) c.PCR扩增：32P，35S 上游引物：24~26组，10mer 下游引物：同反转录 共计288～312种PCR反应

  37. 扩增条件： 前1~4个循环采用不严格扩增条件(降低退火温度， 增加引物与Mg2+浓度)，促使引物与模板的错配； 后续PCR循环则采用严格的扩增条件。 d.电泳：测序胶或非变性聚丙烯酰胺凝胶，放射自显影 e.克隆：PCR差异带的回收、扩增和克隆 f.Northern blotting鉴定：排除假阳性 g. 序列分析：Blast，递交新序列 h.全长基因： RACE或筛选cDNA文库 i.基因功能研究：生物信息学

  38. 基因片段的开放读框 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html 氨基酸序列的功能结构域分析 http://www.smart.embl-heidelberg.de http://www.ebi.ac.uk/interproscan/ipsearch.html

  39. 注意： a.与常规PCR不同，该方法可以保持样品中不同模板的相对比例; b.由于某一刺激因素常常影响数十、甚至数百基因的表达变化，但并不是每个基因的表达变化在此过程都起着重要的作用; c. 电泳显示的单一扩增带并不表明它只含有单一的基因。 优点：操作简单、敏感、快速、重复性好、要求的起始RNA量少、 可同时检测某因素作用下表达升高与降低的基因。 缺点：大规模地筛选，假阳性率高，得到的多为短片段，且都靠近3´端 发展：EDD、ODD、GDD、LDD、FDD(增强、有序、基因组、长程、荧光)

  40. ＃消减杂交：又称扣除杂交，克隆差异表达的基因＃消减杂交：又称扣除杂交，克隆差异表达的基因

  41. (3)基于图谱的基因克隆方法：依赖于遗传图谱和物理图谱， (3)基于图谱的基因克隆方法：依赖于遗传图谱和物理图谱， 可用于分离与已知分子标记紧密连锁的基因。 方法：染色体跳查：速度快，200kb片段 染色体步查：40kb片段 举例：囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)---囊性纤维化(常隐) 亨廷顿病基因(HD)---亨廷顿病(常显) 肌营养不良基因(MD)---肌营养不良症(X隐)

  42. 3. 文库的构建与目的基因的克隆 基因文库：指采用体外克隆技术得到的一个重组DNA分子群体。 分类：按组成基因文库的重组DNA片段的供体来源分为两类 cDNA文库：重组DNA片段来源于细胞表达出的mRNA， 用于某类特定细胞中基因组的表达状态以及 表达基因的功能鉴定的研究。 基因组文库：重组片段供体是某种特定生物个体的基因组DNA， 主要用于基因组物理图谱构建、基因组序列分析、 基因在染色体上的定位、基因组中基因的结构和 组织形式分析等方面的研究。

  43. (1)cDNA文库 步骤：合成cDNA，连接到质粒/噬菌体载体上， 转化或感染大肠杆菌，产生cDNA文库。 类型：表达型：采用表达型载体，插入的cDNA片段可表达成融合蛋白， 具抗原或生物学活性，可用抗体等作为探针进行筛选。 非表达型：只能用核酸探针筛选包含目的基因的克隆。 λ噬菌体载体系统：最早使用，装载容量大，适合于全长cDNA克隆， 易于长期保存，可采用的文库筛选的方法有限。 质粒载体系统：体外操作简便，载体的可塑性强，可进行功能性筛选， 插入片段的载体容量小，含有长片段的重组克隆易丢失， 保存条件严格。 噬菌体载体系统：可进行功能性筛选 哺乳类细胞表达载体：反转录病毒载体是最常用的系统

  44. cDNA = copy DNA

  45. cDNA文库的筛选： a. 基于核酸相互杂交分离目的基因 同源探针：mRNA差异显示 利用种属间基因同源性，从EST数据库中搜寻 兼并性寡核苷酸探针 cDNA探针 b. 基于基因编码蛋白的检测筛选cDNA表达文库 噬菌体表面展示系统 酵母双杂交系统 酵母单杂交系统

  46. (2)基因组文库 概念：是由大量独立克隆形成的群体， 指能够代表某种有机体整个基因组的一套克隆。 步骤：DNA样品的制备－用限制性内切酶酶切基因组DNA－ 电泳分离回收约20kb的大片段－与限制性内切酶处理载体连接－ 在体外包装成噬菌体颗粒，侵染大肠杆菌－文库的扩增 载体：λ噬菌体载体：可容纳20kb的插入片段，易于操作， 筛选体系完整，容量偏小。 黏粒载体：载体容量大，可容纳45kb的DNA片段，不易操作。

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