Régulation

1. Régulation Nécessité et mécanismes

2. FLUX: L’organisme se procure quelques composés, en synthétise la majorité… La vitesse d’approvisionnement (FLUX à travers la voie métabolique) doit répondre à ses besoins. Pour y arriver, il va CONTROLERL’ACTIVITE des enzymes, et REGULERLA CONCENTRATION des métabolites intermédiaires.

3. Contrôle de l’activité enzymatique: • Quantité: synthèse et dégradation • Activité: • Régulation covalente • Régulation non covalente

4. Synthèse/dégradation

5. Augmentation de l’activité enzymatique Tryptophane 2-3, dioxygénase (t1/2 2.5h) Pyruvate kinase (t1/2 24h) Ornithine décarboxylase (t1/2 0.3h) 2.5 5 7.5 10 Temps (heures) Synthèse-dégradation: cinétique

6. Demi vies dans le foie de rat: (extrait de: Fundamentals of Enzymology (3rded) N.C. Price et L. Stevens Oxford University Press)

7. Recyclage individuel des protéines!

8. Contrôle de la synthèse et de la dégradation: • Transcription • Stabilité de l’ARNm (séquences « UA riche », etc) • Traduction • Dégradation de la protéine (séquences « PEST », ubiquitinylation, SUMOylation, mais aussi protéolyse régulée de la HMG CoA réductase, « down-regulation » des récepteurs, etc.) Souvent: régulation coordonnée de toute la voie

9. Prokaryotes: opérons ( lac) Fatty acid synthase Eucaryotes: activité multi enzymatique,homologie promoteurs

10. Régulation covalente: autres • Phosphorylation: Ser/Thr • (glycogène phosphorylase, glycogène synthase, Ac CoA carboxylase, F2,6 bis phosphatase/PFK2, GPCRs, etc, etc) • Phosphorylation: Tyr • (voie de signalisation de l’insuline, de facteurs de croissance) • ADP-ribosylation • (protéines G, glutamine synthétase, RNA polymérase, etc) • Adenylylation, uridylylation, etc • (glutamine synthétase E Coli, etc)

11. Régulation non covalente: • Concentration adéquate de substrat, de cofacteur • Accumulation du produit • Inhibiteurs/activateurs allostériques • Protéines inhibitrices (BPTI / trypsine, protéine nucléaire / glycogène synthase, glycogène phosphorylase a / glycogène synthase phosphatase, etc)

12. Enzymes allostériques et enzymes coopératives • Enzymesallostériques: • Enzymes réguléespar des composés ne ressemblant ni au substrat, ni au produit de la réaction Exemples: inhibition de la phosphofructokinase par l’ATP, … • Enzymes coopératives: • Enzymes multimériques, cinétique de forme « sigmoïde » { v = fct( [S]n) } Remarque: PAS SYNONYMES!Même si la majorité des enzymes coopératives sont également allostériques, et si beaucoup d’enzymes allostériques sont également coopératives vis-à-vis d’au moins un substrat.

14. Enzyme coopérative, ou “de type K”:l’aspartate transcarbamoylase

15. Aspartate transcarbamoylase bactérienne:enzyme coopérative et allostérique ZOOM: +ATP Controle +ATP Controle +CTP +CTP Début de la synthèse des bases puriques: (d)CTP, UTP, dTTP; Inhibé lorsque les purines sont disponibles; activé lorsque les pyrimidines ( (d)ATP, (d)GTP ) sont disponibles

16. Courbe sigmoïde: pourquoi? vitesse R R vitesse T T [S] [S] L’enzyme coopérative existe en 2 conformations: R et T. A faibles [S], T prédomine; les courbes v et T sont confondues à très petit [S]. Lorsque [S] augmente, le % R augmente: la vitesse se rapproche de la courbe R

17. S S S S S S S S Monod, Jacob et Changeux: R T Deux conformations préexistantes, changement coordonné. Chaque ligand (substrat, activateur, inhibiteur) favorise une des deux conf.

18. S S S S S S Koshland, Néméthy et Filmer: Deux conformations possibles pour chaque sous unité, chaque ligand peut induire une des deux conformations. Les ligands n’affectent que la sous unité qu’ils occupent

19. S S S S La réalité: un mélange de ces deux modèles? Monod-Wyman-Changeux Koshland-Néméthy-Filmer R4 R3T R2T2 R2T2 RT3 T4 S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S

20. Régulation d’une enzyme coopérative par des régulateurs allostériques: 1 Activateur, stabilisant R 0.5 Inhibiteur stabilisant T 0 0 2 4 6 8 10 Enzyme allostérique, 2 sites (T/R = 100) Enzyme allostérique activé (T/R = 10) Enzyme allostérique inhibé (T/R = 1000)

21. Enzyme Michaelienne versus coopérative: apparemment pas grande différence au niveau des vitesses?

22. Mais…pas du tout le même effet sur le « Flux » à travers la voie métabolique: { Orifice étroit à la base, s’élargit, puis redevient très étroit } { orifice large à la base, devient de plus en plus étroit }

23. Pourquoi? Zoom sur les petites concentrations de Substrat: Enzyme Michaelienne: v varie moins que S  Flux augmente, mais moins que [S]

24. Enzyme coopérative  Flux augmente, plus que [S] Enzyme coopérative: v varie plus que S

25. Régulation d’une enzyme coopérative et allostérique: Inhibiteur, stabilisant la conformation « T », Activateur, stabilisant la conformation « R »

26. Régulation de voies métaboliques: Coordonnée, à plusieurs niveaux. Pourquoi?

27. Régulation de la glycolyse et du cycle de Krebs: Glucose

28. Synthèse et de la dégradation du glycogène: AMPc Glycogène Glucose P

29. Synthèse et de la dégradation du glycogène : glucose (Glycogène +Pi)  Glucose-P UDP-glucose  glycogène

30. Questions: On observe en règle générale plusieurs mécanismes de contrôle dans une voie métabolique. • Comment identifier l’enzyme qui contrôle effectivement la voie? • A quoi servent les autres contrôles? • Pourquoi une telle multiplication des contrôles?

31. Lorsqu’une même voie conduit à plusieurs produits, comment l’organisme s’arrange-t-il pour avoir en permanence une synthèse adéquate de tous les produits? • Une vitesse de réaction « Michaelienne » passe de 10% à 90% du maximum lorsque la [S] passe de 0.1 à 10 KM («la réponse se développe sur 2 logarithmes »). • Comment obtenir une réponse « oui/non » (division cellulaire, apoptose, …) • au contraire, une réponse graduelle sur 7 à 8 logarithmes (vision)?

32. Flux, contrôle et régulation? Le problème: comprendre comment l’organisme s’arrange pour obtenir ce dont il a besoin sans gaspillage: Il doit pouvoir contrôler le Flux à travers chaque voie de synthèse ou de dégradation, tout en régulant la concentration des métabolites intermédiaires…

33. Flux, contrôle et régulation: • « Flux » :vitesse de production (et d’utilisation) des différents métabolites dont l’organisme a besoin. (Par analogie: ventes et réapprovisionnement d’un supermarché) • « Contrôle » : capacité du système à obtenir un flux adéquat pour répondre à la demande. (Par analogie: bouton de réglage de la température d’un frigo.) • « Régulation » : capacité de l’organisme à maintenir la concentration des métabolites intermédiaires à un niveau plus ou moins constant. (Par analogie: capacité du frigo à maintenir une température constante, proche de la température demandée, quelque soit le nombre d’ouvertures de la porte et la température demandée.)

34. Enzyme « rate limiting »??? • Quelle est l’enzyme qui contrôle la vitesse de la cascade de réaction: • La plus lente? • La moins concentrée? • Le lièvre, ou les tortues???

35. Quelle étape devrait on contrôler? • A l’état stationnaire, toutes les réactions se produisent à la même vitesse: c’est ce qu’on appelle le « Flux » à travers la voie métabolique. • Traditionnellement, on suppose que l’étape qui contrôle le flux devrait être une réaction irréversible, particulièrement lente. • Mais: crédible?

36. Le « rate limiting step »: légende ou réalité? A  B  C  D  E… Supposons: • Réaction B  C (par exemple) particulièrement lente • A et B ↑, et C ↓ • Si C ↓  vitesse réaction C  D ralentie (loi d’action des masses), • Si A et B ↑ vitesse de transformation BC accélérée, jusqu’à atteindre une vitesse équivalente à C  D

37. Rappel: comment visualiser le flux?

38. Diminution d’une activité enzymatique  accumulation des métabolites en amont, déplétion des métabolites en aval de. Dangereux, voire même toxique? Risque d’emballement d’autres voies?

39. Rappel: forme de « l’écluse » qui relie les canaux ? Vmax/KM ou KS

40. Repas Cascade de réactions irréversibles: • Apport dans le premier bassin ↑, •  niveau ( [S1] ) ↑  vitesse ↑, •  le niveau ([S2]) ↑, etc. • Difficulté : ↑ du flux suffisante, sans (trop) ↑ [métabolites intermédiaires]! Glycémie (veine porte) GLUT 4 / Glucokinase/ phosphoglucomutase Glucose 1P UDP-glucose pyrophosphorylase UDP-Glucose glycogène synthase Glycogène

41. Rôle de la régulation: • Régulation nécessaire pour maintenir [métabolites] ≈ , quelle que soit la demande (par exemple: régulation de la glycémie lors de l’effort et du repos) • Nécessité de contrôler le flux(vitessede production). • Pour contrôler la vitesse de chaque réaction : modifier KM, Vmax , [enzymes], proportion d’enzyme en conformation active, etc…

42. vitesse Outils:Effet d’une augmentation / diminution de la quantité d ’enzyme ou de son activité (Vmax)? [S]

43. vitesse [S] Effet d’une diminution de KM?

44. Enzyme coopérative: Ressemble à un tuyau: le « bas » de l’écluse s’évase. Idéal pour conserver une concentration stable de substrat !

45. Inhibition d’une enzyme coopérative et allostérique(composé favorisant la conformation T) Inhibiteur favorise T Activateur favorise R inhibition / activation surtout aux faibles [S]

46. « Metabolic Control Analysis »: Formalisme mathématique, permet la description quantitative du contrôle du flux à travers une voie métabolique, et de sa régulation par les différents mécanismes qui ont étés identifiés par les biochimistes.

47. Intérêt: • Permet de valider les « impressions » qualitatives sur l’importance des différents mécanismes de contrôle observés • Permet (en théorie) de contrôler qu’on a bien identifié tous les mécanismes de régulation, et d’en évaluer l’importance relative • Explique pourquoi on observe en général des changements « coordonnés » de la concentration de tous les enzymes impliqués dans une voie métabolique

48. Dans le but de quantifier l’effet de chaque mode de régulation, Kacser et Burns puis Heinrich et Rapoport ont défini trois fonctions: • Elasticité, εsv: mesure la variation de la vitesse de chaque réaction prise séparément. • Coefficients de contrôle du flux, CEJ: mesure la variation du flux(càd. à traversl’ensemblede la voie) lorsque E change. • Coefficients de contrôle de métabolite, CEM: mesure la variation de chaque [métabolite](à l’état stationnaire) lorsque Ej change.

49. Élasticité:

50. Mesure le déséquilibre substrats / produits Fraction de E occupé par S