聚丙烯酰胺凝胶双向电泳

1. 聚丙烯酰胺凝胶双向电泳

2. 第一部分 实验简介 一、实验目的 通过双向电泳实验，初步掌握电泳的基本理论、双向电泳实验的设计原理和实验技能。 二、实验原理 根据不同的蛋白质具有不同的分子量和等电点的特点。利用这一性质首先通过毛细管聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦技术将不同等电点的蛋白质分开，然后通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳将相同或相近等电点而分子量不同的蛋白质进行相对分子量分离。经过二维电泳分离的蛋白质在二维电泳图谱所处的位置，就是该蛋白质的相对分子量和等电点。

3. 三、实验流程 蛋白样品的制备 ↓ 等电聚焦凝胶溶液的配制 ↓ 灌注毛细管凝胶 ↓ 组装第一向电泳槽 ↓ 聚焦电泳 ↓ 停止电泳 ↓ 取出毛细管胶 ↓ 毛细管胶置平衡液中平衡

4. ↓ 组装第二向电泳槽 ↓ 配制SDS-丙烯胺凝胶溶液 ↓ 灌装SDS-电泳胶 ↓ 第一向凝胶与第二向凝胶拼接 ↓ 接通电源进行SDS-电泳 ↓ 停止电泳取胶 ↓ 凝胶置固定液中固定 ↓ 银染法显色 ↓ 结果分析

5. 第二部分 实验方法 第一向电泳——毛细管等电聚焦电泳（IEF） 1.仪器准备 双向电泳系统一套（见清单） 烧杯1000 mL 、50 mL 各1个 量筒1000 mL （或500 mL）、100 mL 、10 mL各 1个 注射器1 mL（带长针头）、微量注射器100μL（或50μL）各1支 大塑料盒1个 滴管1支

6. 2．溶液配制 (1)覆盖溶液（25 mL/班）含8 mol/L尿素，1%两性电解质pH 3~9.5，5% (w/v) NP40(Nonidet P 40 Substitute)和100 mmol/L DTT 取12 g尿素，0.25 mL两性电解质(pH 3~9.5)，12.5 mL的10%的NP40和0.386 g DTT，用重蒸水溶解后，定容到25mL。溶液不能受热,储存在冰箱中。 (2)平衡溶液（250 mL/班）Tris-HCl( pH 6.8)缓冲液，含2% SDS，100 mmol/L DTT和10%甘油 15 mL Tris-HCl(pH 6.8)，50 mL 10%SDS，3.86 g DTT和29 mL甘油，用重蒸水定容到250 mL，室温存放。

7. (3) 30% Acrylamide第一向储液（100mL/班）含28.4% (w/v) acrylamide和1.6% (w/v) N,N'-methylene-bis-acrylamide 用重蒸水先将1.6 g bisacrylamide溶解后，再加入28.4 g acrylamide，溶解，用重蒸水定容到100 mL。如果溶液混浊，需要进行过滤。溶液存放在棕色瓶中，4°C贮藏，3~4星期内使用。 (4) 10%(w/v) NP40（20mL/班）配制100 mL溶液，称量10 g NP40，用重蒸水定容到100 mL，室温存放。 (5) 20 mmol/L NaOH 配制500 mL，称0.4 g NaOH用蒸馏水定容到500 mL。

8. (6) 10 mmol/L H3PO4配制2000 mL，量取1.35 mL H3PO4(85%)用蒸馏水定容到2000 mL。 (7)固定液乙醇35mL，三氯乙酸10 g，磺基水杨酸3.5 g，加蒸馏水定容到100 mL。 (8)脱色液乙醇25 mL，冰乙酸10 mL，加蒸馏水定容到100 mL。 (9) 10%过硫酸铵 0.1 g过硫酸铵溶于1mL重蒸水中，在4ºC冰箱中可保存3~4个星期。

9. 3．实验步骤 (1)准备玻璃管取4支18 cm的长玻璃管，洗净晾干。 (2)配制第一向凝胶溶液（8mL /4组）配制方法见表1。 表1 第一向凝胶溶液配方 尿素 3.84 g 重蒸水 2.0 mL 30% Acrylamide储液 1.6 mL 搅拌溶解 10% NP40 1.5 mL 两性电解质(pH3~9.5) 0.50 mL 10% 过硫酸铵* 15 µL TEMED* 10 µL

10. (3)灌制第一向凝胶（每组2人共制作4根胶柱） 取1支1 mL注射器和一根长针头，吸取约0.5mL第一向凝胶溶液，再取1支玻璃管，用手指垫一块封口膜堵住玻璃管的一端，将长针头全部插入玻璃管中，一边注入凝胶溶液一边后退针头，注意针头不要露出胶面, 直至凝胶溶液到达玻璃管顶端，撤出针头，用滤纸擦干玻璃管口的凝胶溶液，然后用封口膜封住该端管口，将玻璃管倒置，将长针头从玻璃管的另一端插入管内凝胶液面下，用同样方法加入凝胶溶液至距管口2cm处，将玻璃管垂直放置，然后立即用微量注射器在胶面上加少量重蒸水覆盖，大约30 min后凝胶聚合。

11. (4)加样待凝胶聚合后，用微量注射器吸去覆盖在胶上的重蒸水。在每根胶柱上加20~30 µL蛋白质样品溶液，然后再加入覆盖溶液至管口。 (5)安装电泳槽加样后将玻璃管插入电泳槽的架子上，在上槽中玻璃管上端露出1 cm，剥去玻璃管下端的封口膜，准备电泳。在电泳槽的下槽加2000 mL 10 mmol/L H3PO4溶液，将柱胶下端浸入到H3PO4溶液中，注意胶下端不可有气泡(如果有气泡，可以先用注射器将胶下端用H3PO4溶液灌满，再将柱胶插入H3PO4溶液中)。上槽倒入500 mL 20 mmol/L NaOH溶液，盖上电泳槽盖，注意正负电极。

12. (6)聚胶电泳 在1000~1500 V的电压下进行电泳，直至电流接近于为零(大约7~8 h)停止电泳。如果聚焦好的凝胶不能马上进行第二向电泳，在管内放置了几小时以上, 可在走第二向电泳之前再聚焦电泳1~2h，以消除样品受扩散的影响。 (7)退胶 电泳结束后，在整极端凝胶内插入约1cm长的铜丝作为标记，用洗耳球从玻璃管上样端轻轻挤入空气，将凝胶退胶或用10mL注射器和长针头吸入一定的蒸馏水，将长针头一边沿管壁推入一边注入蒸馏水使凝胶退出。

13. （8）平衡: 将推出的一条凝胶条放入盛有10ml平衡液的小烧杯中，浸泡平衡20 min，然后进行第二向电泳. (9)染色: 另一条胶放入固定液中固定1~2 h，用考马斯亮蓝R250染色1 h，再用脱色液脱色，观察第一向聚焦效果。

14. 第二向电泳--SDS-聚丙烯酰胺凝胶电（SDS-PAGE） 1．溶液配制 (1) 30% Acrylamide第二向储液（500 mL/班）含29.1% (w/v) acrylamide和0.9% (w/v) N,N'-methylene-bis-acrylamide，配制方法同第一向储液。 (2) 10% SDS 称10 g SDS用重蒸水溶解，定容到100 mL，室温存放。

15. (3)分离胶缓冲液（300 mL/班）1.5 mol /L Tris-HCl缓冲液，pH8.9。 称Tris 109 g，取1 mol/L HCl 144 mL，用重蒸水定容至300 mL，4°C保存。 (4)浓缩胶缓冲液（300 mL/班）0.5 mol /L Tris-HCl缓冲液，pH8.9。 称Tris 6 g，取1 mol/L HCl 48 mL，用重蒸水定容至100 mL，4°C保存。 (5)电极缓冲液（2500 mL/2组）称6 g的Tris，29 g甘氨酸，2.5 g SDS，用蒸馏水定容到2.5 L。

16. (5)电极缓冲液（2500 mL/2组）称6 g的Tris，29 g甘氨酸，2.5 g SDS，用蒸馏水定容到2.5 L。 (6)固定液乙醇50 mL，冰醋酸10 mL，用蒸馏水定容至100 mL。 (7)染色液0.25 g考马斯亮蓝R-250，40 mL乙醇，10 mL冰醋酸，用水定容到100 mL。 (8) 10%过硫酸铵、脱色液同第一向电泳。

17. 2．实验步骤 (1)组装夹心式玻璃板、制胶支架底座调水平； 取一块长玻璃板和一块带磨口槽的短玻璃板，将短玻璃板带磨口槽的一边位于上端与长玻璃相对，两玻璃板之间的左、右两端各放入一条间隔条，对齐，插入玻璃板固定夹，将上面的固定螺丝拧紧，将此夹心式玻璃板放入制胶支架底座，插入凸轮，向内侧推入并旋转180º，夹心式玻璃板即被固定。

18. (2)分离胶配制 分离胶按照凝胶浓度不同分为三层，自下而上浓度递减，每层高度约4~5 cm，分别按照表2配制，并依次灌制。 试剂 凝胶浓度 18% 12% 7% 30% Acrylamide储液 /mL 7.2 4.8 2.8 分离胶缓冲液 /mL 3.0 3.0 3.0 重蒸水 /mL 1.6 4.0 6.0 10% SDS /mL 0.12 0.12 0.12 TEMED /µL 20 20 20 10% AP /µL 30 30 30 总体积 /mL 12 12 12

19. (3)灌注分离胶 首先将配制的第一层凝胶溶液用滴管沿着长玻璃板内侧缓缓加入凝胶腔，小心不产生气泡，然后用少量1/4浓度的分离胶缓冲液封胶面（高度约2 mm），凝胶聚合大约30min。 待凝胶聚合后用滤纸片吸干封胶缓冲液 ，灌注第二层凝胶溶液，并封胶面。 凝胶聚合后灌注第三层凝胶溶液，最终凝胶距离短玻璃板上沿3 cm左右, 最后用1/4浓度的分离胶缓冲液封胶面（约20 mm）。

20. (4)配制和灌注浓缩胶 用滤纸吸去分离胶上面封的分离胶缓冲液，然后加入浓缩胶溶液，插入样品槽模板，凝胶溶液应到达短玻璃板上沿，聚合0.5~1 h。浓缩胶溶液配制方法见表3。

21. 试剂 凝胶浓度 5 % 30% Acrylamide储液 /mL 2.5 浓缩胶缓冲液 /mL 2.0 重蒸水 /mL 10.2 10% SDS /mL 0.15 TEMED /µL 30 10% AP /µL 45 总体积 /mL 15

22. (5)安装第二向电泳装置 在冷却槽上取下红色密封条，安装上白色密封条，将夹心式凝胶板从灌胶支架底座上取下，安装在冷却槽上。

23. (6)凝胶拼接 ①将平衡好的胶条用少量的电极缓冲液漂洗，摆放在一块干净的玻璃板上，胶条的正极端位于小加样槽一端。胶条两端各切去约2 cm，使凝胶长度略短于加样槽； ② 轻轻拔出样品槽模板，在小加样槽中加入5~10 µL标准蛋白质； ③ 用滴管将已加热融化的用电极缓冲液配制的1％琼脂快速加在浓缩胶上，使琼脂在浓缩胶上铺开形成一层水平的胶层，琼脂高度为1~2 mm；

24. ④ 待琼脂凝固，将放着胶条的玻璃板靠近短板，使胶条滑入槽内，平铺在琼脂上，将胶条与琼脂胶紧密结合； ⑤ 用滴管加融化的琼脂于胶条上，使到达短板上沿，将胶条包埋； ⑥ 滴加融化的琼脂到玻璃板与冷却槽交接处，密封上槽。

25. (7)电泳 将电泳装置放入电泳槽中，在上槽中灌入电极缓冲液，缓冲液高过短板，其余缓冲液到入下槽，应高过凝胶板下沿2 cm。盖上电泳槽盖子，接通电源，恒压60V，电泳30 min，样品进入凝胶后，调节恒压250V，电泳至溴酚兰到达分离胶底部1cm左右时停止。 (8)固定 倒去电极缓冲液，拆开电泳槽，取下凝胶板，放入固定液中，室温过夜。

26. (9)染色和脱色 用考马斯亮蓝R250染色液染色2 h，用脱色液脱色，直至背景清晰。 (10)实验结果 凝胶扫描。

27. 蛋白质银染色技术 1、准备试剂 甲醇、 1000ml 冰醋酸、 500ml 甲醛 100ml DTT 500mg AgNO3 5000mg Na2CO3 60g

28. 2、试剂配制（每个组） (1) 40％甲醇－10％冰醋酸 150ml。 (2) 10％甲醇-5％冰醋酸 150ml。 (3) 5μg/ml的DTT溶液 150ml。 (4) 0.25％AgNO3溶液 150ml。 (5) 3％Na2CO3溶液 150ml。 (6) 3％Na2CO3溶液（内含60-100μl/100ml甲醛）150ml。 (7) 5％的冰醋酸溶液 150ml。

29. 3\操作步骤 ① 将胶置于150ml 40％甲醇－10％冰醋酸中浸泡，摇动固定过夜。 ② 取出胶，置于120ml 10％甲醇-5％冰醋酸中浸泡，摇动固定30min。 ③ 用去离子水将胶浸泡、漂洗，第一、二次，每次间隔20min。 ④ 去离子水摇动漂洗，第三、四次，每次间隔30min换水一次。 ⑤ 倾出去离子水，加入5μg/ml的DTT溶液120ml，摇动浸泡30min。

30. ⑥ 用去离子漂洗一次，然后将胶放在120ml 0.25％AgNO3中浸泡30min。 ⑦ 用大量的去离子水将胶漂洗约2-3min。 ⑧ 将凝胶放入120mL 3％Na2CO3溶液中浸泡3-5min。 ⑨ 将凝胶放在3％Na2CO3溶液（内含120μl/120ml甲醛，可根据情况增减）的显影液中显影。 ⑩ 等蛋白斑点清楚后，将胶放在5％的冰醋酸溶液中10min停止反应。用蒸馏水将胶漂洗干净。