1 / 36

Matthias Craig

Université de Liège Centre d’Ingénierie des Protéines Recherche de nouveaux métabolites secondaires chez les Streptomyces La Condromycine: Histoire d’un antibiotique mort-né …. Matthias Craig. Introduction. Streptomycètes Bactéries Gram + filamenteuses colonisant les sols. Introduction.

fay
Download Presentation

Matthias Craig

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript


  1. Université de LiègeCentre d’Ingénierie des ProtéinesRecherche de nouveaux métabolites secondaires chez les StreptomycesLa Condromycine: Histoire d’un antibiotique mort-né … Matthias Craig

  2. Introduction Streptomycètes Bactéries Gram + filamenteuses colonisant les sols

  3. Introduction • Streptomycètes • Producteurs de 2/3 métabolites secondaires utilisés en médecine et dans l’industrie agroalimentaire

  4. Introduction • Streptomycètes • Séquençage des génomes de S. coelicolor et S. avermitilis révèlent la présence de nombreux clusters « cryptiques ».

  5. Introduction Les bactéries pathogènes multirésistantes aux antibiotiques posent un grave problème médical.  recherche de nouvelles molécules. Le groupe Strepto a décidé de rejoindre l’ensemble du CIP dans cette cette aventure.

  6. Quels sont les signaux environnementaux perçus déclenchant le passage du métabolisme primaire au métabolisme secondaire ?

  7. Criblage de la collection de Streptomyces du CIP pour la recherche de nouveaux antibiotiques Souche S. sp. G2 • Streptomyces sp G2 produit un métabolite secondaire inhibant la croissance de bactéries Gram-positives (MRSA). Spectre de masse: 1079 Da et présence d’un atome de bore

  8. Il existe trois antibiotiques naturels caractérisés contenant un atome de bore * Le tartrolon: - Produit par Sorangium cellulosum • Mw = 888 Da * L’aplasmomycine: • Produite par Streptomyces griseus • Mw = 799 Da * La boromycine: • Produite par Streptomyces antibioticus • Mw = 866 Da

  9. Objectifs du doctorat • Caractérisation génétique, biochimique et morphologique de la souche G2. • Détermination des propriétés physico-chimiques de l’antibiotique. • Optimisation de la production de l’antibiotique dans le but de la détermination de sa structure tridimensionnelle par RMN (en collaboration avec le Professeur Luxen, ULg). • Recherche de la cible de l’antibiotique. • Identification des gènes responsables de la biosynthèse de la condromycine (clonage et séquençage du cluster de gènes).

  10. Résultats • 1) Génotypage de Streptomyces sp G2 en amplifiant, clonant et séquencant le gène codant pour les RNA 16S et les Internallytranscribedspacers (ITS).

  11. 16 h 22 h 40 h 46 h 112 h TSB + glycérol 1% MM + glycérol 1% MM + glucose 1% MM + chitine 1% MM + mannitol 1% MM + GlcNAc 1% TSB + glycérol 1% + chitine 0,5% Mise au point des conditions optimales de croissance de S. sp. G2 et de production de condromycine en milieu liquide.

  12. Mise au point des conditions optimales de croissance de S. sp. G2 et de production de condromycine sur milieu gélosé. MM + glycérol 1% MM + chitine 1%R2YE MM + MM + mannitol 1%

  13. Mise au point d’un protocole de production et de purification de condromycine. La souche S. sp. G2 ne produit plus l’antibiotique en milieu liquide. • Mutagenèse chimique au NTG Substitution: GC  AT

  14. NP II NPIV NP V NP VIII S. sp. G2 SP IV SP VIII SP XII témoin NP II NPIV NP V NP VIII S. sp. G2 SP IV SP VIII SP XII témoin Screening des colonies après incubation des spores avec du NTG et caractérisation des mutants potentiels • 15 mutants potentiellement surproducteurs • 21 mutants potentiellement non producteurs • 3 mutants présentant un phénotype fortement altéré Non producteur S. sp. G2 Surproducteur Mutant brun • 9 mutants surproducteurs confirmés

  15. 4 cultures de 250 ml en TSB + glycérol 1% + chitine 1% Purification: • Extraction liquide-liquide • Purification trois pics sur colonne semipréparative.  35 mg pics A, B et C

  16. Activité biologique Enterococcus faecium Enterococcus faecalis Enterococcus hirae ATCC 9790 Enterococcus hirae EHR Enterococcus hirae R40 Enterococcus hirae SRI Escherichia coli JM109

  17. Propriétés physico-chimiques 5795,6 • Spectres UV: • Stabilité thermique et résistance aux protéases. • Spectre de masse. Pronase 4 μg/mL 24 h 37°C 90°C 1h30 1282,1 597,4 1267,9 control traitement

  18. Production et purification de la condromycine sur milieu gélosé. 100 boîtes de milieu R2YE (2,5 litres)  spores du mutant surproducteur SPXII. Condromycine extraite du milieu gélosé en présence d’acétate d’éthyle. Purification par HPLC (colonne C18) et séparation des trois pics.  150 mg

  19. Spectre de masse des pics A, B et C

  20. spectre 1H obtenu de fraction B Litt.: Spectre 1H de actinomycin D … Et c’est l’embardée … • Pic A: 1254,7  Actinomycin D : 1255,4 • Pic B: 1268,8  Actinomycin C2 : 1269,4 • Pic C: 1282,8  Actinomycin C3 : 1283,5 Condromycine = Actinomycine? • Masses très proches • Spectre d’absorption similaire • Même activité (actif contre les gram +) • Même spectre RMN du proton

  21. CONDROMYCINE  ACTINOMYCINE

  22. Objectifs • Caractérisation génétique, biochimique et morphologique de la souche G2. • Détermination des propriétés physico-chimiques de l’antibiotique. • Optimisation de la production de l’antibiotique dans le but de la détermination de sa structure tridimensionnelle par RMN (en collaboration avec le Professeur Luxen, ULg). • Recherche de la cible de l’antibiotique. • Identification des gènes responsables de la biosynthèse de la condromycine (clonage et séquençage du cluster de gènes).  S. sp. G2 = Sous-espèce de S. griseus Masse, spectre UV, stabilité thermique, stabilité en fonction du pH, hydrophobicité, … Se lie à l’ADN empêchant la transcription en ARN  hautement toxique.

  23. Recherche de nouveaux métabolites secondaires • Criblage de la collection de Streptomycètes du CIP. Génotypage des souches non identifiées

  24. Recherche de nouveaux métabolites secondaires • Criblage de la collection de Streptomycètes du CIP. • Méthodologie « dasR » Facteur de transcription pléiotropique. • Métabolisme de la GlcNAc. • Scan du génome de S. coelicolor pour identifier les sites dre (dasR-responsive element). ActII-4 et redZ.

  25. Recherche de nouveaux métabolites secondaires 2) Méthodologie « dasR » DNA array BAP29 vs S. coelicolor M145 M145 BAP29 ActII-4 redZ

  26. Recherche de nouveaux métabolites secondaires 2) Méthodologie « dasR ». DNA array BAP29 vs S. coelicolorM145 coelicheline

  27. Recherche de nouveaux métabolites secondaires 2) Méthodologie « dasR » DNA array BAP29 vs S. coelicolorM145 Gray spore pigment

  28. Recherche de nouveaux métabolites secondaires 2) Méthodologie « dasR » DNA array BAP29 vs S. coelicolorM145 Gènes SCO6273 à SCO6288 régulés par scbR et scbA en amont desquels on retrouve un site dre. scbR scbA

  29. Recherche de nouveaux métabolites secondaires 2) Méthodologie « dasR » DNA array BAP29 vs S. coelicolorM145 SCO6280 = KasO SCO6273

  30. Recherche de nouveaux métabolites secondaires Et en pratique… 1 2 3 4 1 = M145 MM + mannitol 1% 2 = BAP29 MM + mannitol 1% 3 = M145 MM + GlcNAc 1% 4 = BAP29 MM + GlcNAc 1% MM MM + GlcNAc M145 ΔdasR

  31. Recherche de nouveaux métabolites secondaires BAP29 MM + GlcNAc 1% Spot noir provenant de la TLC

  32. Recherche de nouveaux métabolites secondaires 1 2 3 4 1 = M145 LB + glucose 1% 2 = BAP29 LB + glucose 1% 3 = M145 LB + chitine 1% 4 = BAP29 LB + chitine 1%

  33. Recherche de nouveaux métabolites secondaires Jus de culture BAP29 LB + glucose 1% Pic 1 Pic 2 Spot fluorescent provenant de la TLC

  34. Perspectives Effet de la GlcNAc sur d’autres Streptomycètes. Streptomyces clavuligerus 1 2 3 4 5 6 1 = MM + mannitol 1% 2 = MM + GlcNAc 1% 3= MM + glucose 1% 4 = MM + glucose 1% + GlcNAc 1% 5 = MM + chitine 1% 6 = MM + chitine 1% + GlcNAc 1%

  35. Perspectives PCR pour identifier les souches de la collection possédant le gène dasR. Inactivation du gène  Réveil de métabolites cryptiques? Etudier le métabolome des souches de la collection sur différents milieux en présence de différentes sources de carbone et d’azote.  Nouveau(x) métabolite(s) à caractériser…

  36. Merci pour votre attention … Sébastien Rigali et toute l’équipe strepto Bernard Joris Jérôme Paris

More Related