단백질 분석

1. 단백질 분석 SDS-PAGE

2. 단백질 분리 # 단백질 분리는 분리하고자 하는 단백질이 무엇인가(핵에 존재하는지 단백질인지 세포질에 존재하는지)에 따라서, 또 단백질의 성질에 따라서 적당한 방법을 선택 하는 것이 우선이다. 흔히 조직이나 세포로부터 핵단백질이나 세포질단백질 또는 전체단백질을 분리하는 것으로 시작해서, 수많은 정제과정을 거쳐 원하는 단백질을 분리해 낼 수 있다. # 일반적으로 단백질을 추출할 때 사용되는 detergent는 amphiphilic molecules로 hydrophobic tail 부분과 hydrophilic head 부분으로 구성되어 있다. 두 부분이 서로 결합하여 micelle을 형성하는데, solubilized protein은 lipid-detergent mixed micelle을 형성하고 transmembrane protein은 protein-lipid-detergent complex를 형성한다. 이렇게 micelle을 형성하는 정도를 CMC (critical micelle concentration)라 하는데 이것은 고효율 및 고순도의 단백질 정제에 중요한 역할을 하며 pH, 온도, ionic strength, multivalent ions of organic solvents, 및 detergent 순도 등에 의해 좌우된다. 그리고 특성에 따라 detergent는 ionicdetergent, non-ionic detergent, 및 zwitterionic detergent로 나눌 수 있다.

3. # Ionic detergent는 SDS, LiDS, DOC 등과 같은 cationic 및 anionic detergent로 다시 나뉘며 이들은 highly denaturant로 monomeric protein으로 단백질을 분리시키는 특성이 있어 Western blot analysis 및 분자량 측정 등에 주로 이용한다. 그리고 Triton X-100과 같은 non-ionic detergent는 less protein denaturant이기 때문에 protein-protein interaction등에 주로 이용된다. 또한 CHAPS 등과 같은 zwitterionic detergent는 head 부분에 negative 및 positive charge를 동시에 갖고 있으며, non-ionic detergent보다 protein-protein interaction에 더욱 효율적이며 ionic detergent보다 protein denaturation 정도가 적다. 이처럼 단백질을 추출할 때는 적절한 buffer 및 detergent를 선택하여 사용해야 한다.

4. 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 • # 단백질의 전기영동은 아크릴아미드와 비스아크릴아미드를 결합시킨 중합시킨 폴리아크릴아미드 겔을 사용하며 농도가 증가할수록 구멍의 크기가 작아지므로 분리하고자 하는 단백질의 분자량에 따라 겔 농도를 정한다. • # 폴리아크릴아미드 겔은 분자 채 역할을 하여 단백질은 분자량에 비례하여 이동한다. 그러나 단백질은 저마다 전하량이 다르고 모양도 다양하여 분자량으로 이동속도를 예측하여 단백질을 분리할 수 없다. 때문에 단백질 전기영동시 음이온 세제인 SDS와 이황화물결합을 끊는 2-mercaptoethanol을 처리해준다.

5. 원리 # 보통 SDS-PAGE는 두가지의 다른 gel이 붙어있는 상태인 Disc(discontinuous pH 또는 disc) gel 전기영동으로 시행하게 된다. 이를 사용하면 단백질 시료가 gel에 apply되었을 때 모든 시료가 같은 점에서 출발할 수 있도록 압축이 되고, 그 다음에 성질에 따라 분리되게 된다. 따라서 두 gel의 농도나 pH가 다르게 설정되어 있다. 윗부분의 gel은 stacking gel이라 부르며, acrylamide 농도는 주로 3~5%이고 pH는 running gel보다 2 정도 낮은 6.5를 주로 쓰게 된다. 아래의 gel은 running gel, resolving gel, separating gel 등으로 불리며, acrylamide 농도는 분리하고자 하는 단백질의 크기에 따라 6~15%를 주로 사용한다.

6. # Gel의 윗부분 완충용액(upper chamber buffer)의 glycine은 아미노산의 성질로 인해 음전하를 띠거나 net charge가 0인 zwitter이온 형태로 존재한다.Gel에 형성된 well에 단백질 시료를 가하고 전기영동을 시작하면 Cl-이온과 단백질, glycine-이온이 모두 +극을 향해 출발하게 된다(Zwitter이온은 움직이지 않는다). 그런데 Glycine-은 stacking gel의 낮은 pH에서 다시 평형을 이루어 일부가 zwitter이온이 되어버리기 때문에 이 부분에서 움직이는 이온(mobile ion)이 없어지고, 결과적으로 전류가 감소하게 된다. 그러나 전체 gel 시스템의 전류는 유지되어야 하므로 이를 극복하기 위해 Cl-이온과 glycine-이온 사이에 매우 높은 전압차가 형성된다. 이때 상대적인 이동속도는 glycine- < 단백질 < bromophenol blue < Cl-이 된다(Cl-는 작기 때문에 빠르고, 단백질은 glycine보다 크지만 음전하가 많아서 빠르다). 모든 단백질은 acrylamide 농도가 낮은 gel에서 움직임의 제한을 받지 않고 높은 전압차에 의해 빠르게 이동하지만, Cl-이온 앞쪽이나 glycine-이온 뒤쪽으로는 높은 전압이 없으므로 이 사이(얇은 disc)에 모두 모여 이동되는 셈이다. 이들이 resolving gel에 도달하면 이곳에서 glycine은 높은 pH로 인해 거의 모두 음전하가 되어 위와 같은 효과는 사라지고, 또한 acrylamide의 농도가 높기 때문에 단백질은 크기에 따라서 분리가 시작되게 된다

7. SDS-polyacrylamide gel의 염색 # Coomassie brilliant blue 염색

8. Western blot analysis # Western blot은 여러 단백질의 혼합물로부터 어떤 특정단백질을 찾아내는 기법으로서 찾고자 하는 단백질에 대한 항체를 사용하여 항원-항체 반응을 일으킴으로써 특정단백질의 존재여부를 밝혀낸다. 여러 단백질을 SDS, urea 또는 2-mercaptoethanol과 같은 환원제로 용해시킨 후 SDS-polyacrylamide gel 전기영동한 후 Coomassie brilliant blue로 염색하여 전기영동으로 분리된 단백질 대(band)를 확인하거나 nitrocellulose 또는 nylone membrane에 옮긴 후(단백질을 옮기는 이 과정을 western blot 또는 western transfer라고 한다) 단백질이 옮겨진 membrane에서 항원-항체 반응을 이용 특정 항체에 대한 항원(단백질)을 찾아내는 기법이다.

9. # 이때 사용하는 항체는 찾고자 하는 항원(단백질)에 대해 특이하게 반응하는 것을 방사성 동위원소로 표식하여 사용하거나 또는 특정 효소(예: alkaline phosphatase, horseradish peroxidase 등) 또는 형광을 나타내는 색소(예: FITC: fluorescein isothiocyanate)를 결합시킨 것을 이용함으로서 찾고자 하는 적은 양의 단백질을 가시화할 수 있다.