Bacilos Gram Negativos

1. Bacilos Gram Negativos Fermentadores - Enterobactérias

2. Enterobactérias • As enterobactérias possuem características em comum que definem a família Enterobacteriaceae: São bacilos Gram-negativos; Fermentam a glicose com ou sem produção de gás; São aeróbios e anaeróbios facultativos; A maioria reduz nitrato a nitrito; A maioria é oxidase negativa e catalase positiva; Podem ser móveis por flagelos peritríqueos ou imóveis; Crescem bem em meios comuns de cultura, como ágarMacConkey.

3. Importância clínica • As enterobactérias são universalmente distribuídas no solo, plantas, na água e no trato gastrointestinal de humanos e dos animais • As Enterobacteriaceae podem ser isoladas de vários sítios infecciosos e são responsáveis por: - Abscessos; - Pneumonia; - Meningites; - Septicemias; - Infecções de feridas, trato urinário e trato gastrintestinal. • Alguns também são considerados enteropatógenos por causarem preferencialmente infecções gastrintestinais, como a Salmonellatyphi, outras Salmonellas, Shigellaspp., Yersiniaenterocoliticae vários sorotipos de Escherichiacoli, embora possam também causar infecção em outros sítios.

4. Importância clínica • As principaisenterobactériasisoladas, constituindocerca de 99% dos isolamentos de enterobactérias de importânciaclínica, são: • Escherichia coli; Klebsiellaspp.; Enterobacterspp.; Proteus spp.; Providenciaspp.; Morganellaspp.; Citrobacterspp.; Salmonella spp.;Shigellaspp.; Serratiaspp. • As enterobactériasqueatualmentepredominamsão: • Escherichia coli; • Klebsiella spp.; • Enterobacter spp. • As isoladas com menorfreqüênciasão: • Edwardsiellaspp.; • Hafniaspp.; • Yersiniaspp.

5. Isolamento • A amostra clínica deve ser enviada imediatamente ao laboratório clínico após a coleta. • Em casos onde não é possível o envio ao laboratório em no máximo até 2 horas, manter a amostra refrigerada. • Amostras coletadas em swab podem ser colocadas em meio de transporte tipo Cary-Blair e/ou meio de Amies. • Amostras de sangue devem ser imediatamente inoculadas em frascos apropriados para hemocultura. • As enterobactérias crescem bem em meios comuns de cultura e meios seletivos utilizados para o isolamento de bacilos Gram-negativos. • A maioria delas apresenta colônias maiores de 1 mm de diâmetro, após incubação de 18 a 24 horas a 35±2ºC, com aspecto opaco, brilhante, transparente ou mucóide.

7. Identificação • Baseia-se principalmente na presença ou não de diferentes enzimas codificadas pelo material genético dos cromossomos bacterianos. • Estas enzimas participam do metabolismo bacteriano em diversas vias, que podem ser detectadas por meios especiais utilizados em técnicas de cultivo in vitro.

8. Identificação • A caracterização definitiva dos membros das Enterobacteriaceae pode requerer uma bateria de provas bioquímicas. • Primeiramnete confirmar se é enterobactéria: *Fermentação da glicose; *Citocromooxidase negativa; *Redução de nitrato a nitrito.

9. Identificação • Os passos importantes a serem avaliados para a identificação das enterobactérias são:Exame macroscópico e microscópico da cultura • O exame macroscópico e microscópico da cultura constitui a primeira etapa da identificação das enterobactérias. • O exame macroscópico da cultura permite uma análise do tamanho, aspecto morfológico e coloração da colônia em meios simples e seletivos. • O exame microscópico se faz através da coloração de Gram

10. Identificação bioquímica • Após o exame macroscópico e a confirmação da pureza da cultura, uma colônia pode ser identificada com a ajuda de meios presuntivos de identificação, tais como o meio de Triple SugarIron (TSI), EPM Mili e/ou Rugai modificado por Pessoa e Silva (Meio de IAL). • No meio de IAL, nove reações bioquímicas são observadas em um único tubo: • Fermentação da glicose; • Produção de gás; • Fermentação da sacarose; • Desaminação do L-triptofano; • Produção de indol; • Produção de sulfeto de hidrogênio (H2S); • Hidrólise da uréia; • Descarboxilação da lisina (LDC); • Motilidade. • O exame presuntivo acompanhado de provas complementares auxilia na confirmação de um gênero ou espécie. • As provas complementares geralmente necessárias são a descarboxilação da ornitina (ODC), arginina de-hidrolase (ADH), utilização do citrato (Simmons), prova da DNase e prova de VogesProskauer (reação de VP), e, quando necessário, a fermentação de alguns açúcares.

11. VP • A reação de VP divide as enterobactérias em dois grandes grupos: espécies VP positivas e espécies VP negativas • Em geral, entre os membros mais comuns da família, as espécies VP positivas pertencem aos gêneros Klebsiella, Enterobacter e Serratia. As espécies dos gêneros Salmonella, Shigella, Proteus, Morganella, Citrobacter, Kluyvera, Providencia e a Escherichiacoli apresentam reação de VP negativa.

12. Características para o diagnóstico presuntivo e triagem dos gêneros e espécies de enterobactérias mais comuns em material clínico. •  As cepas de E.coliapresentam distintos perfis em meio presuntivo de identificação. Isto se deve à grande variabilidade bioquímica que existe entre as cepas, especialmente em relação à produção de gás a partir da fermentação da glicose, fermentação da sacarose, LDC e motilidade. • No entanto, fermentam a lactose e produzem indol, características que praticamente definem a espécie.

13. Cepas de Salmonellaproduzem pouco gás a partir da fermentação da glicose, são em geral lactose negativas, sacarose negativas e possuem como uma das principais características a produção de H2S .

14. As cepas com suspeita de Shigella apresentam um perfil bioquímico muito homogêneo e característico nos meios presuntivos de identificação: • Raramente produzem gás; • São LDC negativas e imóveis.

15. O gênero Citrobacter possui 11 espécies. Todas as espécies são LDC negativas, citrato positivas e a maioria fermenta a sacarose, a lactose e o glicerol, características que diferenciam as espécies de Citrobacter de Salmonella.As espécies de Citrobacter diferenciam-se entre si pela produção de H2S (6 das espécies são H2S positivas), produção de indol, ODC, utilização do malonato e a fermentação de vários açúcares.

16. Cepas deKlebsiella possuem um metabolismo muito ativo. • São VP positivas, fermentam a maioria dos carboidratos e colônias mucóides, lactose positiva, são extremamente comuns, são imóveis e a maioria das espécies é LDC positiva. A produção de urease é característica das espécies K. pneumoniae e K. oxytoca, as mais comuns em material clínico

17. Enterobacter é um dos gêneros que possui o maior número de espécies. • São VP positivas, a maioria das cepas de todas as espécies são móveis e extremamente variáveis bioquimicamente. • As principais características diferenciais entre E. aerogenes, espécie LDC positiva, e K. pneumoniae são a motilidade e a produção de urease. • LDC, ODC e ADH são excelentes testes para triagem inicial das espécies de Enterobacter.

18. Outro gênero VP positivo, as culturas de Serratiaem meio presuntivo de identificação são muito semelhantes as cepas de Salmonellasem H2S. • A maioria é LDC positiva, lactose negativa e produz pouquíssimo gás a partir da fermentação da glicose. • A DNase é um teste fundamental para a identificação de Serratia, e recomenda-se a utilização rotineiramente. • As cepas deSerratia são DNase, lipase e gelatinase positivas. A ausência da fermentação da arabinose e melibiose distingue a S. marcescens, espécie mais comum, das outras espécies de Serratia

19. Os gêneros Proteus, Morganellae Providencia caracterizam-se pela desaminação do triptofano. Diferente dos outros dois gêneros, o gêneroProteus invade a superfície de meios sólidos (swarming), é gelatinase e H2S positiva. • A urease é positiva para os gêneros Proteus, Morganella e Providencia rettgeri. O Proteusmirabilis é indol e maltose negativo e ODC positivo, enquanto que o Proteusvulgaris é indol e maltose positivo e ODC negativo.

22. Kits de identificação LTD LAC H2S GLI GÁS ORN IND LIS MOT CIT RAM 4 2 1 4 2 1 4 2 1 2 1 7 7 7 3

23. Resistência • Os microbiologistas devem estar alerta à possibilidade do aparecimento deEnterobacteriaceae resistentes a múltiplos antibióticos.Os mecanismos de resistência bacterianos podem ser intrínsecos (já presentes em todas as amostras de determinada espécie) ou adquiridos (devido à presença de mutações, aquisição de plasmídeosetc).

25. Resistência • Dentre os mecanismos de resistência adquiridos mais freqüentes entre as enterobactérias, destacam-se os associados à resistência aos β-lactâmicos, pela hiperexpressão de β-lactamases cromossômicas ou presença de β-lactamases de espectro ampliado (ESBL), às fluoroquinolonas, pelas mutações nos genes gyrA e parC, presença do geneqnr, e aos aminoglicosídeos, pela produção de enzimas que modificam estes agentes.

26. Beta-lactamases • A resistência a alguns antimicrobianos, especialmente β-lactâmicos, é freqüentemente encontrada em enterobactérias de infecções em pacientes hospitalizados. Amostras clínicas de enterobactérias, especialmente K. pneumoniae e E. coli, podem produzir uma enzima mediada por plasmídeos denominada ESBL, a qual hidrolisa penicilinas, cefalosporinas e monobactans. A prevalência da produção desta enzima em enterobactérias varia de acordo com a espécie e a região geográfica estudada; entretanto, em determinados centros médicos brasileiros as taxas de ESBL em E. coli e K. pneumoniae coletadas de bacteremias de pacientes hospitalizados podem alcançar aproximadamente 7% e 50%, respectivamente

27. Beta-lactamases • As amostras bacterianas pertencentes aos gêneros Citrobacter, Enterobacter, Serratia, Morganellae isolados de Proteusvulgaris são reconhecidamente produtores de β-lactamasesAmpC. Estas enzimas são codificadas pelo gene AmpC, e sua produção pode ser induzida quando estes isolados clínicos são expostos a agentes β-lactâmicos. A hiperprodução desta enzima pode acarretar hidrólise de cefalosporinas, como ceftazidima e ceftriaxona, ocasionando falência terapêutica durante tratamento com estes agentes. As cefalosporinas de quarta geração e os carbapenens são mais estáveis à hidrólise pela AmpC.

29. Carbapenes • Isolados clínicos de enterobactérias resistentes à carbapenens já foram identificados no Brasil. Os mecanismos de resistência associados a alguns destes fenótipos foram caracterizados por laboratórios de referência em microbiologia, incluindo: • Enterobacterspp. resistentes a ertapenem: hiperprodução de AmpC e/ou produção de ESBLs; K. pneumoniae com susceptibilidade reduzida a imipenem e meropenem: produção de ESBLs associado a perda de proteína de membrana externa (porinas); • K. pneumoniae com resistência a imipenem e meropenem: produção de enzimas que degradam os carbapenens (carbapenemases), denominadas KPC; • K. pneumoniaecom resistência a imipenem e meropenem: produção de enzimas que degradam os carbapenens, denominadas metalo-β-lactamases.

30. ESBL • Os testes fenotípicos para ESBL devem ser utilizados para: • Todos os isolados de K. oxytoca, K. pneumoniaeeE. coli, independente do sítio de infecção; • Isolados de Proteusmirabilis provenientes de sítios estéreis de infecção, como sangue e líquor; • A partir da identificação destas espécies pelo laboratório de microbiologia, o perfil de sensibilidade (antibiograma) já contempla automaticamente testes para a possível presença destas enzimas. Estes testes, realizados pelos laboratórios de rotina, dividem-se em duas fases: testes de triagem e testes confirmatórios para ESBL. • O CLSI preconiza que o teste de triagem seja realizado pelos métodos de disco difusão (ágarMüeller-Hinton-MHA) ou microdiluição em caldo (Müeller-Hinton caldo cátion ajustado-CAMHB).Teste de triagem para detecção de ESBL pelo método de disco difusão:Suspeita-se de cepa produtora de ESBL, quando são encontradas zonas de diâmetro referentes a: • Para K. pneumoniae, K. oxytoca e E. coli: • Cefpodoxima ≤ 17 mm; • Ceftazidima ≤ 22 mm; • Aztreonam ≤ 27 mm; • Cefotaxima ≤ 27 mm; • Ceftriaxona ≤ 25 mm. • Para P. mirabilis: • Cefpodoxima ≤ 22 mm; • Ceftazidima ≤ 22 mm; • Cefotaxima ≤ 27 mm.

31. Teste confirmatório para detecção de ESBL pelo método de disco difusão: • Todas as cepas produtoras de ESBL, apresentam aumento na zona de diâmetro na presença do ácido clavulânico. Confirma-se como ESBL o microrganismo que apresentar um aumento ≥ 5 mm na zona de diâmetro para um dos dois agentes antimicrobianos testados em combinação com o ácido clavulânicoversus a zona de diâmetro de quando testado sozinho.Exemplo: Ceftazidima com zona de diâmetro igual a 16 mm e ceftazidima/ácido clavulânico com zona de diâmetro igual a 21 mm. Resultado: ESBL positivo ou cefotaxima com zona de diâmetro igual a 20 mm e cefotaxima/ácido clavulânico com zona de diâmetro igual a 26 mm. Resultado: ESBL positivo.

32. Teste confirmatório recomendado pelo CLSI Teste de adição de Ác. Clavulânico índice • Ácido Clavulânico • Preparar 1000 l de solução estoque (1 g/l)fresca ou congelada a –70°C • Adicionar 10 l desta solução sobre os discos de CAZ e CTX uma hora antes do teste • Comparar os resultados obtidos entre cefalosporinas sozinhas e com adição de ácido clavulânico

33. Detecção de amostras produtoras de ESBL Disco-difusão dupla ou teste de aproximação índice Jarlier, 1988 CPM AMX/AC CRO/ CTX CAZ Distância de 20 - 30 mm ATM