第 13 章色谱分析法导论

填充柱色谱 毛细管柱色谱柱色谱平板色谱按固定相的固定方式分类纸色谱薄层色谱平板色谱

吸附色谱 分配色谱离子交换色谱排阻色谱根据分离机理可分为

迎头法 顶替法洗脱法根据展开程序可分为

色谱法的特点和应用 1.分离效能高 2.灵敏度高可检测10-11~10-13g,适于痕量分析.色谱分析需试样量极少(g或ng). 3.分析速度快 4.应用范围广缺点：对未知物的定性分析比较困难。方向：高选择性检测器；联用技术（ GC-MS、GC-FTIR、LC-MS、LC-NMR等）。

§13-2色谱分离原理 一、分离原理特点：不同组分在柱中移动速度不等；各组分沿柱子扩散分布。

二、分配系数和容量因子 1. 分配系数（平衡常数）K 指在一定和温度和压力下，组分在两相间达到分配平衡时，组分在固定相中的浓度cs与组分在流动相中的浓度cm之比。 K：与温度、压力有关外，还与组分性质、固定相和流动相性质有关。不同组分K值的差异，是实现色谱分离的先决条件。

2、容量因子（分配比）k 指在一定温度和压力下，组分在两相间达到分配平衡时，组分在固定相中的质量 p 与组分在流动相中的质量 q 之比。分配系数与容量因子关系：称为相比

k'：与温度、压力有关外，还与组分性质、固 定相和流动相性质及  有关。 K 与 k' 是两个不同的参数，但在表征组分的分离行为时，二者完全等效。 k' 可以方便地从色谱图直接求得，所以它是一个重要的色谱参数。

§13-3色谱图及常用术语 由检测器输出的信号强度对时间作图，所得曲线称为色谱流出曲线。曲线上突起部分就是色谱峰。如果进样量很小，浓度很低，在吸附等温线（气固吸附色谱）或分配等温线（气液分配色谱）的线性范围内，则色谱峰是对称的。

一、基线 当没有待测组分进入检测器时,在实验操作条件下，反映检测器噪声随时间变化的曲线称为基线，稳定的基线应该是一条水平直线。二、峰高色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以（h）表示。

三、区域宽度 用于衡量柱效率及反映色谱操作条件的动力学因素。表示色谱峰区域宽度通常有三种方法: 1)标准偏差---即0.607倍峰高处色谱峰宽的一半。 2)半峰宽W1/2---即峰高一半处的峰宽度。它与标准偏差的关系为: W1/2=2.354 3)峰底宽度Wb--即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上截距间的距离。它与标准偏差的关系是 Wb = 4 

四、保留值 1.保留值的定义 (1)死时间tM 不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间. L为柱长(cm) ū为流动相平均线速度(cm/s) (2)保留时间tR 试样从进样到柱后出现峰极大点时所经过的时间，称为保留时间.

(3)调整保留时间tR´ tR´= tR tM 由于组分在色谱柱中的保留时间tR包含了组分随流动相通过柱子所需的时间和组分在固定相中滞留所须的时间，所以tR ´实际上是组分在固定相中保留的总时间。保留时间是色谱法定性的基本依据. 但同一组分的保留时间常受到流动相流速的影响，因此色谱工作者有时用保留体积来表示保留值。

(4)死体积VM 不被保留的组分通过色谱柱所消耗的流动相的体积. VM = Fc·tM Fc:流动相平均体积流速,（单位:cm3·min-1）. (5) 保留体积VR 指从进样开始到被测组分在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。保留时间与保留体积关系： VR = Fc·tR (6)调整保留体积VR 某组分的保留体积扣除死体积后，称为该组分的调整保留体积。 VR = VR VM = tR Fc

2. 保留值与平衡常数K 的关系 根据物料平衡：两边同除以cm: 平衡常数K＝cs/cm，且Vm≈VM: 或: 该式是色谱过程的基本方程，它将反映色谱行为的保留值（ VR、 V'R 、 VM）与反映物质性质的热力学常数K联系起来。

3. 保留值与容量因子的关系 将色谱过程基本方程代入：可得：将该式改为：

4.相对保留值 某组分2的调整保留值与组分1的调整保留值之比，称为相对保留值。由于相对保留值只与柱温及固定相性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它在色谱法中，特别是在气相色谱法中，广泛用作定性的依据。在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标准（s），然后再求其它峰（i）对这个峰的相对保留值。

在多元混合物分析中，通常选择一对最难分离的物质对，将它们的相对保留值作业重要参数，称选择因子，用符号表示，即 式中tR (2)为后出峰的调整保留时间，所以总是大于1的。 可作为衡量固定相选择性的指标。 越大，越容易分离。=1，分离不能实现。

α是两个组分平衡常数或容量因子之比，是两组分在色谱体系中平衡分配差异的量度，是热力学参数。它是柱温、组分的性质、固定相和流动相的性质的函数。而与其它实验条件，如柱径、柱长、填充情况及流动相流速等无关。是广泛使用的定性数据。

从色谱流出曲线中，可得许多重要信息： (1) 根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含组分的最少个数； (2) 根据色谱峰的保留值，可以进行定性分析； (3) 根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分析； (4) 色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据； (5) 色谱峰两峰间的距离，是评价固定相（或流动相）选择是否合适的依据。

KA > KB 浓度 A B A B 沿柱移动距离 L §13-4 色谱法基本理论下图是 A、B两组分沿色谱柱移动时，不同位置处的浓度轮廓。若要使A、B组分完全分离，必须满足以下三点：第一，两组分的分配系数必须有差异；第二，区域扩宽的速率应小于区域分离的速度；第三，在保证快速分离的前提下，提供足够长的色谱柱。

第一、二点是完全分离的必要条件。作为一个色谱理论，它不仅应说明组分在色谱柱中移动的速率，而且应说明组分在移动过程中引起区域扩宽的各种因素。塔板理论和速率理论均以色谱过程中分配系数恒定为前提，故称为线性色谱理论。第一、二点是完全分离的必要条件。作为一个色谱理论，它不仅应说明组分在色谱柱中移动的速率，而且应说明组分在移动过程中引起区域扩宽的各种因素。塔板理论和速率理论均以色谱过程中分配系数恒定为前提，故称为线性色谱理论。

1 塔板理论 把色谱柱比作一个精馏塔，即色谱柱是由一系列连续的、相等的水平塔板组成。每一块塔板的高度用 H 表示，称为塔板高度，简称板高。塔板理论假设：在每一块塔板上，溶质在两相间很快达到分配平衡，然后随着流动相按一个一个塔板的方式向前转移。对一根长为 L 的色谱柱，溶质平衡的次数应为： n 称为理论塔板数 n 越大或 H 越小,柱效率越高,分离能力越强.

塔板理论指出： 第一，当溶质在柱中的平衡次数，即理论塔板数 n 大于50时，可得到基本对称的峰形曲线。在色谱柱中，n 值一般很大，如气相色谱柱的 n约为103 -106，因而这时的流出曲线可趋近于正态分布曲线。第二，当样品进入色谱柱后，只要各组分在两相间的分配系数有微小差异，经过反复多次的分配平衡后，仍可获得良好的分离。第三，n 与半峰宽及峰底宽的关系式为：式中tR与W1/2 ( Wb)应采用同一单位（时间或距离）。 tR一定时，色谱峰越窄，n 越大，H 越小，柱效能越高。

在实际工作中，计算出来的n和 H 值有时并不能充分地反映色谱柱的分离效能，因为采用tR计算时，没有扣除死时间tM，所以常用有效塔板数 n有效表示柱效：有效板高：

在相同的色谱条件下，对不同的物质计算的塔板数不一样，因此，在说明柱效时，除注明色谱条件外，还应指出用什么物质进行测量。比较柱效时，必须把操作条件固定下来，用同一种物质通过不同的色谱柱,分别计算出n有效进行比较.在相同的色谱条件下，对不同的物质计算的塔板数不一样，因此，在说明柱效时，除注明色谱条件外，还应指出用什么物质进行测量。比较柱效时，必须把操作条件固定下来，用同一种物质通过不同的色谱柱,分别计算出n有效进行比较. 例：已知某组分峰的峰底宽为40 s，保留时间为400 s ，计算此色谱柱的理论塔板数。解：

塔板理论 一种半经验性的平衡理论贡献缺点 • 用热力学的观点阐明了溶质在色谱柱中的分配平衡和分离过程 • 解释了流出曲线的形状及浓度极大值的位置 • 提出了计算和评价柱效的参数 • 不能解释造成谱带扩张的原因和影响板高的各种因素 • 不能说明同一溶质为什么在不同的流速下，可以测得不同的理论塔板数

2 速率理论 1956年荷兰学者van Deemter（范第姆特）等在研究气液色谱时，提出了色谱过程动力学理论——速率理论。他们吸收了塔板理论中板高的概念，并充分考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，从而在动力学基础上较好地解释了影响板高的各种因素。该理论模型对气相、液相色谱都适用。

van Deemter方程的数学简化式为 ū 为流动相的平均线速度，单位：cm/s； A、B、C、为常数，分别代表涡流扩散系数、分子扩散项系数、传质阻力项系数。

（1）涡流扩散项A 在填充色谱柱中，当组分随流动相向柱出口迁移时，流动相由于受到固定相颗粒障碍，不断改变流动方向，使组分分子在前进中形成紊乱的类似涡流的流动，故称涡流扩散。 A = 2λdp dp: 填充物的平均直径 λ:填充不规则因子， A 与流动相的性质、线速度和组分性质无关。对于空心毛细管，不存在涡流扩散，因此 A = 0。

(2)分子扩散项—B / ū（纵向扩散项） ：弯曲因子，填充柱色谱， <1。 Dg：试样组分分子在气相中的扩散系数（cm2·s-1）。与组分性质、载气性质、柱温、柱压等因素有关。宜采用相对分子质量较大的载气（如N2），较高载气线速度，较低柱温。

(3) 传质阻力项 Cū 物质系统由于浓度不均匀而发生的物质迁移过程，称为传质。影响该过程的阻力，称为传质阻力。传质阻力系数C包括气相传质阻力系数Cg和液相传质阻力系数C1两项，即 C = Cg+ C1

气相传质过程是指试样组分从气相移动到固定相表面的过程。气相传质过程是指试样组分从气相移动到固定相表面的过程。采用粒度小的填充物和相对分子质量小的气体（如氢气）做载气，可使Cg减小，提高柱效。

液相传质过程是指试样组分从固定相的气/液界面移动到液相内部，并发生质量交换，达到分配平衡，然后又返回气/液界面的传质过程。液相传质过程是指试样组分从固定相的气/液界面移动到液相内部，并发生质量交换，达到分配平衡，然后又返回气/液界面的传质过程。降低固定液的含量，可以降低液膜厚度，但k值随之变小，又会使C1增大。当固定液含量一定时，液膜厚度随载体的比表面积增加而降低，因此，一般采用比表面积较大的载体来降低液膜厚度。虽然提高柱温可增大D1，但会使 k’ 值减小，为了保持适当的C1值，应控制适宜的柱温。

当固定液含量较高，液膜较厚，载气以在中等的线速下时，板高主要受液相传质系数Cl的控制。此时，气相传质系数值很小，可以忽略。当固定液含量较高，液膜较厚，载气以在中等的线速下时，板高主要受液相传质系数Cl的控制。此时，气相传质系数值很小，可以忽略。 • 然而，随着快速色谱的发展，当采用低固定液含量柱和高载气线速进行分析时，气相传质阻力就会成为影响塔板高度的重要因素。

将上面式总结，即可得气液色谱板高方程 这一方程对选择色谱分离条件具有实际指导意义，它指出了色谱柱填充的均匀程度，填料颗粒的大小，流动相的种类及流速，固定相的液膜厚度等对柱效的影响。

3 液相色谱中的速率理论 液液色谱的 Van Deemter 方程式可表达为： Ⅰ项，Hed ，涡流扩散项。 Ⅱ项， Hmp ，流动区域内，流动相传质阻力。 Ⅲ项， Hld ，分子扩散项，通常可以忽略。 Ⅳ项， Hsm ，流动相停滞区域内的传质阻力项。 Ⅴ项， Hsp ，固定相传质阻力，与气相色谱中液相传质阻力项相应。 Ⅲ Ⅴ Ⅰ Ⅱ Ⅳ

由上式可知，在液液色谱中提高柱效可采用以下方法：由上式可知，在液液色谱中提高柱效可采用以下方法： 1、减小填料颗粒粒度dp； 2、用黏度较低的溶剂作流动相； 3、采用低流速流动相； 4、减小填料空穴深度； 5、适当提高柱温。

4.范氏方程曲线

§13-5分离度 1、柱效和选择性理论塔板数 n 是衡量柱效的指标，反映了色谱分离过程动力学性质。选择性因子  是衡量色谱柱选择性的指标，取决于组分在固定相上的热力学性质。 2、分离度的定义分离度又叫分辨率或分辨度，既能反映柱效率又能反映选择性的指标，是衡量分离效能的总指标。定义：或

不同分离度时色谱峰分离的程度 一般说，当Rs<1时，两峰有部分重叠；当Rs=1时，分离程度可达98%；当Rs=1.5时，分离程度可达99.7%。通常用Rs=1.5作为相邻两组分已完全分离的标志。

3 分离度的公式 分离度概括了色谱过程动力学和热力学特性，是衡量色谱术分享效能的总指标。分离度受n、α和k'三个参数的控制。设有两相近色谱峰A、B，同时假设Wb(A) =Wb(B)。由 tR(A)=tM(1+ k'A） tR(B)=tM(1+ k‘B）而基本色谱分离方程式

(1)分离度与柱效的关系 增加柱长，可提高分离度，但延长了分析时间，因此降低板高，提高柱效，才是提高分离度的好方法。

(2) 分离度与选择因子的关系 当  = 1时，R = 0，这时，无论怎样提高柱效也无法使两组分分离。显然，  大，选择性好。研究证明  的微小变化，就能引起分离度的显著变化。如达到相同分离度，当＝1.01时，所需时间是＝1.1时的84倍。一般通过改变固定相和流动相的性质或降低柱温，可有效增大  值。

第 13 章 色谱分析法导论