PCR - Einführung

1. PCR-Einführung Guido Heymann

2. Was ist PCR? • PCR steht für polymerase chain reaction(Polymerase Kettenreaktion) • Hierbei wird ein beliebiger Bereich der Erbsubstanz (DNS = Desoxyribonucleinsäure) vervielfältigt. • Der spezifisch vervielfältigte Abschnitt kann dann in weiteren Reaktionen eingesetzt werden.

3. Was brauche ich für die PCR? • DNS • Polymerase • freie Nucleotide • Puffer und MgCl2 • Thermocycler • Agarosegel mit Farbstoff • Elektrophoreseeinheit • Photoanlage

4. Was genau ist DNS? DNS ist eine schwache Säure, ein Polymer aus Nucleotidbasen (A, T, C, G), Desoxyribose und Phosphat. Je zwei Polymerstränge fügen sich zu einer Doppelhelix zusammen. Hierbei binden die Basen nicht beliebig, sondern komplementär: A-T, C-G

5. Das biogenetische „Grund“-Gesetz X DNA  RNA  Protein rT

6. Was ist der genetische Code? Im Code der RNA wird die Base Thymin = T gegen Uracil = U ersetzt.

7. Was ist eine Mutation? Ausgangssequenz DIE RNA HAT NUR DEN RAT DEN DIE DNA IHR GAB Sense Mutation DIE RNS HAT NUR DEN RAT DEN DIE DNA IHR GAB Nonsense Mutation DIE RNA DAT NUR DEN RAT DEN DIE DNA IHR GAB Insertion mit Frameshift DIE RNA AHA TUN RDE NRA TDE NDI EDN AIH RGA B Deletion mit Frameshift DIE RNA ATN URD ENR ATD END IED NAI HRG AB Deletion ohne Frameshift DIE RNA HAT DEN RAT DEN DIE DNA IHR GAB Inversion DIE RNANED RUN TAHRAT DEN DIE DNA IHR GAB

8. Ist eine Mutation immer relevant?

9. Ist eine Mutation immer relevant (II)? • homozygot • heterozygot • dominant • rezessiv

10. Wie isoliert man DNS? • Material: • EDTA, Citrat, Zellkultur • ungünstig: Heparin, Vollblut geronnen • Silica-Säulchen • weitere Methoden: • Aussalzung (CsCl2) • Beads-Methode (magnetisch) • Phenol-Chloroform-Gradient

11. Was sind Nucleotide? dNTPs: dATP dTTP dCTP dGTP ddNTPs

12. Was ist eine Polymerase? 1974: Klenow Fragment 1979: Thermophilus aquaticus Taq-Polymerase stabil bis 109°C Hot-start: monoklonaler Antikörper an Taq-P, Start erst nach Erhitzung 80°C.

13. Was ist ein Thermocycler? programmierbarer Heizblock klassischer Zyklus: 1: 96°C DNA-Denaturierung 2: 60°C Primerannealing 3: 72°C Taq-Arbeitstemperatur 1-3 Wiederholung bis 40x 4: 4°C

14. Prinzip der PCR-SSP Genomischer DNA-Doppelstrang bei Erhitzung auf >92°C denaturiert.

15. Prinzip der PCR-SSP Primerannealing bei 37 - 72°C 5´ Antisenseprimer 3´ 3´ Senseprimer 5´

16. Prinzip der PCR-SSP Primerannealing mit Basenmismatch 5´ Antisenseprimer 3´ Senseprimer Da Mismatch keine Elongation 3´ 5´

17. Prinzip der PCR-SSP Elongation durch Taq-Polymerase bei 72°C Wiederholung Denaturierung, Annealing und Elon- gation, bis PCR-Cyclen beendet. 5´ 3´ 3´ 5´

18. Wie stelle ich DNS nun dar? - Kathode + Anode

19. Wie stelle ich DNS nun dar?

20. Wie stelle ich DNS nun dar? Coomassie/Methylen-Blau Ethidiumbromid

21. Wie stelle ich DNS nun dar (II)? • PCR-SSP • PCR-SSO • PCR-SBT • RFLP

22. PCR-Fakten • Die tatsächliche Effizienz der PCR liegt üblicherweise bei 70-80%. • Nach etwa 35 Zyklen wird ein Plateau erreicht: • Anstieg der Schmelztemperatur • Reannealing in Konkurrenz zur Primeranlagerung • Abnahme der Primerkonzentration • Hitzestreß auf Taq-Polymerase (T1/2 bei 95°C 40 Min.) • 3´-5´-Exonucleaseaktivität der Taq-Polymerase

23. Andere Einflußfaktoren • Qualität der DNA-Matrize • PCR-Puffer: • Tris-HCL, NH³/KCL... • Magnesiumchlorid • über dNTP-Konzentration, da dNTPs Mg wegen negativer Ladung binden • Auswirkung wie bei Enzymkonzentration

24. PCR-Förderer und -Inhibitoren • Glycerin: erhöht T 1/2 von Taq-Polymerase • DMSO: löst störende Sekundärstrukturen der Matrize auf, hemmt Taq • Heparin: hemmt Taq-Polymerase • EDTA: kann Mg wegfangen • Häm: Fe hemmt Taq • Detergenzien: können PCR hemmen