IFN-γ 和 ENDOSTATIN 双基因治疗联合放射治疗小鼠转移性乳腺癌的抑瘤作用

1. IFN-γ和 ENDOSTATIN 双基因治疗联合放射治疗小鼠转移性乳腺癌的抑瘤作用 作者姓名（排序）：刘林林，张奇，张伟静，T Conere, M Hurley 作者单位：吉林大学第二医院肿瘤生物治疗科 第一作者姓名及身份证号码：刘林林 220104197010270084 通讯作者姓名：刘林林

2. 一、研究背景 乳腺癌是西方女性中最常见的恶性肿瘤，这些病人中有30-50% 将会发生转移。外科手术、放射治疗和化疗是治疗乳腺癌患者最常用的方法。然而这些常规治疗方式并没有提高局部晚期或者转移性乳腺癌患者的生存率。基因-放射治疗即基因治疗联合放射治疗通过其不同的抑瘤机制在乳腺癌治疗中有着广阔的前景。 IFN-γ由活性T细胞和NK细胞分泌,是第一个由基因工程生产的治疗癌症的细胞因子。 Endostatin(内皮抑素)不仅被发现是有效力的血管生成抑制因子，而且被报道在临床前期的肿瘤模型中有明显的抑瘤效应。 早期反应生长基因1 (Egr-1) 基因可由辐射诱导转录表达，利用Egr-1 作为启动子，IFN-γ 和 endostatin的基因表达可以被辐射诱导加强。

3. 二、材料与方法 • 1.细胞系和实验动物 • 小鼠乳腺腺癌细胞系4T1 购自美国 Type Culture Collection (Manassas, VA)公司。 • 雌性BALB/c小鼠(6-8-周龄，体重 16-20克)购自Harlan(Oxon, U.K.) • 2.小鼠转移性乳腺癌模型的建立 • 小鼠左下腿处乳腺组织注射1×105 的4T1 细胞。一周后当小鼠腿部局部肿瘤生长到直径大约5 mm时，小鼠被随机分为5组。1组为空白对照组；2组为单纯注射空质粒(20 mg)；3组注射pEgr-IFN-γ + pEgr-endostatin质粒；4组为单纯局部接受8 Gy 放疗；5组为局部接受8 Gy 放疗联合pEgr-IFN-γ + pEgr-endostatin 质粒基因治疗组。隔日用卡尺测量肿瘤大小，21天后杀死小鼠并取转移的肺结节计数。另一组动物做生存率的实验。 • 3.ELISA检测细胞培养液上清和肿瘤组织匀浆中 IFN-g 和endostatin 的水平 • 4. Yac-1 和 4T1 cells 分别被用做评价NK and CTL细胞毒活性的靶细胞。其细胞毒效应用Cran ToxiLux 试剂盒检测 (OncoImmunin, Gaithersburg, MD) • 5.肿瘤组织中的微血管密度由兔抗鼠-CD31 单抗检测 (BioLegend, San Diego, CA) 并在40倍和200倍的光学显微镜下计数。

4. 三、结 果 1 体外照射不同剂量转染的4T1细胞的IFN-γ和 endostatin的表达 • 如图1所示，2 到 20 Gy不同剂量的X射线照射转染的4T1细胞4小时后，IFN-γ和 endostatin的表达呈剂量依赖性上升。(p<0.05), IFN-γ水平在5 Gy照射后达到峰值 (图1A) ，而endostatin水平在10 Gy照射后达到峰值 (图1B)。 图1B 不同剂量照射后细胞上清中 endostatin 的表达 图1A 不同剂量照射后细胞上清中 IFN- 的表达

5. 2 体外照射不同时间转染的4T1细胞的IFN-γ和 endostatin的表达 图2B 5Gy照射后不同时间细胞上清中 endostatin浓度的表达 图2A 5Gy照射后不同时间细胞上清中 IFN- γ浓度的表达 • 5 Gy 照射后2, 4, 8, 16, 24, 48, and 72 h ，4T1细胞上清中IFN-γ和 endostatin 浓度与对照组比较上升，具有显著的统计学差异(p<0.05)。见图2A和2B。

6. 3 IFN-γ和endostatin 基因治疗和放射治疗的抑瘤作用 图3A 基因放射治疗对肿瘤生长速率的影响 图3B 基因放射治疗对小鼠肿瘤/体重比的影响 IFN-γ和endostatin 基因联合放射治疗组小鼠的肿瘤生长速率和肿瘤/体重比较对照组明显抑制(p<0.05)。此外，基因联合放射治疗组小鼠的肿瘤生长速率和肿瘤/体重比较单纯基因治疗组(p<0.001) 或单纯放疗组 (p<0.001) 显著降低。见图3A和3B

7. 4 IFN-γ和endostatin 基因放射治疗对小鼠肺结节和生存率的影响 图4 基因放射治疗对小鼠肺转移结节的影响 图5 基因联合放射治疗对小鼠生存率的影响 图4可见，基因联合放射治疗组小鼠的肺结节数较对照组明显降低(p<0.01)。 由图5可见，基因联合放射治疗组小鼠的生存率较对照组明显降低(p<0.01)。

8. 5 联合IFN-γ-endostatin 基因放射治疗抑瘤作用的机制研究 图6C 基因联合放疗后小鼠TNT-a细胞活性 图6A 基因联合放疗后小鼠脾中CTL细胞活性 图6B 基因联合放疗后小鼠脾中NK细胞活性 IFN-γ和endostatin 基因联合放射治疗组小鼠脾中的CTL和 NK细胞活性较对照组显著升高，具有统计学差异(p<0.01)。如图6A和6B。 此外，IFN-γ和endostatin 基因联合放射治疗组小鼠腹腔巨噬细胞的 TNF-a 水平也较对照组显著升高（p<0.05)，见图6C。

9. 6联合IFN-γ-endostatin 基因放射治疗抑瘤作用的机制研究 图7 IFN-γ和endostatin 基因联合放射治疗对小鼠肿瘤血管密度的影响 如图7所示， IFN-γ和endostatin 基因联合放射治疗组小鼠肿瘤血管密度较对照组显著降低（p<0.05)，

10. 四、讨 论 • 1 在本研究中，我们构建了辐射诱导双基因表达质粒pEgr-IFN-γ 和 pEgr-endostatin，并且证明了IFN-γ和endostatin的双基因治疗联合放射治疗在鼠转移性乳腺癌模型中的协同抑瘤效应。 • 2 我们在体外实验中观察到了endostatin和IFN-γ在转染的 4T1 细胞受到辐射后的表达呈时间和剂量依赖性升高。 • 3 我们在小鼠转移性乳腺癌体内试验的研究中也发现，基因联合放射治疗组较对照组、单纯基因治疗组、单纯放射治疗组、空质粒组的抑瘤作用有显著的统计学差异。此种现象也表现在了乳腺癌的肺转移结节的抑制作用。同样，我们也发现 IFN-γ-endostatin 双基因治疗联合放射治疗对荷瘤小鼠有显著的生存受益率。 • 4 研究发现，基因联合放射治疗组小鼠脾脏 CTL 和 NK的细胞毒活性明显高于对照组。我们也观察到在基因联合放射治疗组腹膜巨噬细胞释放的TNF-a 也显著的高于对照组。这些结果提示电离辐射诱导局部IFN-γ 的产生能够激活免疫细胞包括巨噬细胞，NK 细胞，和T 细胞的特异性免疫应答进而增强了抑瘤效应。 • 5 我们在本研究中发现基因联合放射治疗组肿瘤组织中的血管密度显著低于对照组，证实了endostatin的抗肿瘤血管生成的作用进而发挥了其抗肿瘤的作用。

11. 小 结 • 总之, Endostatin和IFN-γ双基因治疗联合肿瘤局部放射治疗的抑瘤效应是通过利用辐射直接杀伤肿瘤细胞的优势，endostatin的抑制肿瘤血管的生成特性，及IFN-γ激活机体免疫应答三方面的共同作用的结果。 • 基因联合放射治疗展现了广阔的肿瘤治疗前景。我们期待未来能通过更多有效载体的构建和多基因治疗的联合来进一步提高肿瘤的局控率和生存率。