Tests de Cytotoxicité

1. Tests de Cytotoxicité Mise en évidence de mort cellulaire I. Test de Bleu de Trypan II. Test de Rouge Neutre III. Test MTT IV. Dosage d’ATP V. Test Lactate Deshydrogénase

2. I . Test de Bleu de Trypan Ce colorant d’exclusion pénètre dans toutes les cellules mais seules les cellules mortes le retiennent et se colorent en bleu, les cellules vivantes apparaissent brillantes. Comptage des cellules après coloration

3. II. Test de Rouge Neutre Colorant vital rouge neutre s’accumule au niveau des lysosomes. Les cellules mortes ne retiennent pas le colorant et ne seront pas coloriées.

4. III . Test de MTT Test basé sur la mesure l’activité d’une enzyme mitochondriale, la succinate déshydrogénase. Dans les cellules vivantes, la succinate déshydrogénase transforme le succinate en fumarate. Cette réaction d’oxydation peut être couplée à une réduction du MTT (jaune) en formazan (bleu-violet) dont la couleur est appréciée par spectrophotométrie à 560 nm. L’intensité de la couleur est proportionnelle à l’activité de la succinate déshydrogénase, elle-même proportionnelle à la viabilité cellulaire

6. IV . Test ATP Ce test est basé sur le dosage de la quantité d’ATP des cellules qui est proportionnelle au nombre des cellules vivantes. Les cellules traitées et lysées sont incubées en présence le luciférase et luciférine. La mono-oxydation de cette dernière par la luciférase, en présence d’ATP et d’oxygène moléculaire produit un signal lumineux proportionnel à la quantité d’ATP présentes dans les lysats cellulaires. LUCIFERASE ATP + D-Luciferin + O2 Oxyluciferin +Mg2+ + AMP + PPi + CO2 + Light

7. V . Test LacatateDeshysdrogénase La LDH est en une enzyme cytosolique catalysant en présence de NADH, la réduction de l’acide pyruvique en acide lactique. Lors d’une atteinte membranaire, l’enzyme est relarguée dans le milieu extracellulaire.

8. La comparaison de l’activité de cette enzyme dans le milieu extracellulaire par rapport à celle mesurée dans le compartiment intracellulaire, reflète le degré de cytolyse d’une culture cellulaire.

9. Mise en évidence de l’apoptose Mise en évidence de mort cellulaire I. Observation microscopique de corps apoptotique II. Fragmentation de l’ADN sur gel d’agarose III. Technique TUNEL IV. Test Annexin V V. Mesure de l’activité des caspase 3 VI. Technique d’immunofluorescence V. Cytométrie en flux

10. 1 . Détection des anomalies de la morphologie cellulaire : Microscopie photonique optique

12. I . Détection des Anomalies de la morphologie cellulaire : microscopie de fluorescence • Exemple de fluorochrome Le DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride) qui se fixe spécifiquement à l'ADN permet l’observation de corps apoptotiques dans une préparation cellulaire .

13. II.Détection de la fragmentation de l’ADN par électrophorèse • Puits 1 : Marqueur de poids moléculaire • Puits 2 : Des cellules sans stimulus apoptotique; • Puits 3 : Des cellules avec un stimulus apoptotique • Puits 4 : contrôle positif. • Source "Roche Diagnostics".

14. L’apoptose est caractérisée par: M Norm Apop Nec Une fragmentation déterminée del’ADN

15. III. Détection de la fragmentation de l’Adn : méthode TUNEL • Principe C’est une méthode de repérage in situ des coupures de l'ADN par l'utilisation de la déoxynucléotidyltransférase ( Tdt, pour Terminal déoxynucléotidyltransférase).

17. 2.Détection de la fragmentation de l’Adn : Méthode TUNEL

18. IV. Détection de l’ Activation des protéases • Principe : L'identification des protéines présentes dans une préparation cellulaire ou tissulaire selon leur poids moléculaire peut se faire à l'aide "western blot" Analyse par "western blot" du précurseur de caspase-3 dans des "lysats" de cellules de A) Jurkat B) HUT 78 C) CCRF-HSB-2

19. IV.Détection des phosphatidyl-sérines par l’Annexine-V: Analyse par cytométrie en flux • Principe Détection des « flip-flop » des phosphatidyl sérines de la membrane plasmique par l’Annexine-V couplée au fluorochrome FITC .

21. V. Technique d’immunofluorescence

22. V.Cytométrie en flux • La cytométrie en flux est une technique permettant de faire défiler des particules, molécules ou cellules à grande vitesse dans le faisceau d'un laser.