5. ESTRUCTURA, PROPIEDADES Y FUNCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

1. 5. ESTRUCTURA, PROPIEDADES Y FUNCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENÉTICO II: Transformación

2. Objetivos • Conocer el fundamento para transformar células bacterianas • Realizar la técnica de transformación bacteriana • Aprender a identificar células transformadas mediante su fenotipo • Conocer la definición de organismo transgénico

3. Ácido dexosirribonucleico(DNA) • Es un ácido nucleico que contiene la instrucción genética que es usada en el desarrollo y funcionamiento de todos los organismos vivos y algunos virus. • El principal papel del DNA es el almacenamiento de información. • DNA es la receta que contiene las instrucciones que se necesitan para la construcción de otros componentes celulares, proteínas, RNA etc. • Los segmentos de DNA que contienen la información genética son llamados genes.

4. El DNA es el portador de lainformación genética en todas las formas de vida celular, así como en muchos virus. En 1944, Oswald Avery, Colin Macleod y Maclyn McCarty después de 10 años de intensa investigación encontraron que el principio transformante purificado de células de Neumococos, poseía todas las propiedades físicas y químicas del DNA, no contenía ninguna proteína que se pudiera detectar no era afectado por tripsina, quimotripsina o ribonucleasa y resultaba totalmente inactivado por tratamiento con DNAsa.

5. Estructura de los ácidos nucleicos

6. DNA. • El DNA es un polímero largo hecho de unidades que se repiten llamadas nucleótidos. • Millones de nucleótidos se encuentran en el DNA, por ejemplo el cromosoma 1 contiene 220 millones de pares de bases de largo. 22 to 26 Å ancho

7. Ácidos nucléicos • Nucleótidos cuyos grupo fosfato unen las posiciones 3’ y 5’ de residuos de azúcar consecutivos.

8. Precedentes hacia el conocimiento de la estructura del DNA • El DNA posee el mismo número de residuos de adenina que de timina (A=T) y el mismo número de residuos de guanina que de citosina (G=C). Estas relaciones, conocidas como las Leyes de Chargaff. • Los nucleótidos están principalmente en las formas ceto, lo que prevee la formación de dobles enlaces entre la adenina y la timina y triples enlaces entre la G y citocina. Fotografía de difracción de rayos X proporcionada por Rosalind Franklin

9. Estructura de doble hélice • Diferentes plegamientos • Forma compacta en los cromosomas

11. Plásmidos • Moléculas de DNA (cadena doble) extracromosómico, covalentemente cerrados. • Generalmente, de tamaño pequeño. • Se encuentran en muchas especies bacterianas. • Se replican de manera independiente del DNA cromosómico.

12. No son necesarios para la sobrevivencia EXCEPTO EN CIRCUNSTANCIAS ESPECIALES. Por ejemplo, muchos plásmidos tienen genes que codifican para la RESISTENCIA AANTIBIOTICOS. En otros son PLASMIDOS de VIRULENCIA, que pueden producir enfermedades

13. Transferencia de DNA • Las bacterias pueden transferir DNA de una bacteria a otra de tres maneras: • Transformación • Transducción • Conjugación.

14. Transferencia de información genética En la transformación, el DNA liberado de una célula bacteriana entra a otra célula, generalmente de la misma especie. Actualmentehemos generado herramientas para realizar la transformación de manera artificial y producimos: Organismos transformantes o transgénicos.

16. Producción de Proteínas Recombinantes de uso médico • Insulina: para diabéticos • Factor VIII: para pacientes con hemofilia A • Factor IX: para hemofilia B • Hormona del crecimiento humana: enanismo • Eritropoyetina: para el tratamiento de anemias • Interferón: defensa contra infecciones • Antígeno de superficie de hepatitis B: vacunas • Activador del plasminógeno tisular: disolución de coágulos

17. Transformación por choque térmico Plásmido o vector Células competentes Fenotipo

18. Los plásmidos usados en ingeniería genética tienen características particulares: Origen de replicación Gen de resistencia a antibiótico Sitio de clonación Múltiple (SCM): o sitio en donde hay secuencias que son reconocidas por enzimas de restricción Parte del operónlac para inducir la expresión del gene y por tanto de la proteína de interés.

19. Vector de clonación pET-24a(+)

20. Vector de recombinación pET-TEM-1 • Un vector de recombinación es la molécula que resulta de la unión de un DNA vector con el DNA de interés (inserto en nuestro caso la -lactamasa). • Un DNA vector es un vector de clonación que permite introducir en una célula hospedera un fragmento de DNA que se pretende clonar; en esta célula hospedera el vector se replica y expresa, en su caso.

21. Vector de recombinación pET- TEM-1

22. Vector con inserto o

23. Transformación por choque térmico Plásmido o vector Células competentes Fenotipo

24. Células competentes • Son las células que han recibido un tratamiento apropiado para llevar a cabo la introducción de material genético • Las bacterias han sido pre-tratadas con agentes que ocasionan el aumento en su permeabilidad membranal como son un aumento en la temperatura, así como de iones que se encargan de cambiar la carga eléctrica de la membrana al recubrir las cabezas polares de lípidos (por ejemplo con iones calcio), lo que disminuye la repulsión de cargas eléctricas entre los fosfatos de los nucleótidos y la membrana y además facilita la entrada del plásmido al interior celular.

25. El experimento