220 likes | 467 Views
MECHANIZMY STABILNEGO DZIEDZICZENIA PLAZMIDÓW NA PRZYKŁADZIE PLAZMIDU pSM19035. Natalia Mieczysławska. plazmidy - samodzielne pozachromosomowe replikony losowy rozdział plazmidów do komórek potomnych systemy wspomagania stabilnego dziedziczenia plazmidów
E N D
MECHANIZMY STABILNEGO DZIEDZICZENIA PLAZMIDÓW NA PRZYKŁADZIE PLAZMIDU pSM19035 Natalia Mieczysławska
plazmidy - samodzielne pozachromosomowe replikony • losowy rozdział plazmidów do komórek potomnych • systemy wspomagania stabilnego dziedziczenia plazmidów • systemy post-segregacyjnego zabijania (PSK) • charakterystyka plazmidu pSM19035
PLAZMIDY • Samodzielne pozachromosomowe replikony • występują u bardzo wielu organizmów prokariotycznych oraz u niektórych eukariontów • cechuje je zdolność do trwałego utrzymywania się (stable maintenance) w komórce i replikowania się w niej w kontrolowany sposób • bardzo różnorodne pod względem rozmiarów, struktury i funkcji • odgrywają znacząca rolę w zdolnościach adaptacyjnych prokariontów i w konsekwencji w ich ewolucji Plazmidy bakteryjne zdolne są do autonomicznej replikacji, za którą odpowiedzialne są regiony (zwykle 1-3kb) zawierające geny kodujące białka replikacyjne, sekwencje regulatorowe oraz miejsce startu replikacji.
LOSOWY ROZDZIAŁ PLAZMIDÓW DO KOMÓREK POTOMNYCH wielkość plazmidu i liczba jego kopii w komórce odgrywa bardzo ważną rolę w stabilnym dziedziczeniu Jeżeli założymy, że podczas losowego rozdziału każda z cząsteczek plazmidu ma takie same szanse dostania się do jednej z dwóch komórek potomnych, wówczas komórki bezplazmidowe będą pojawiać się w populacji z częstością zależną od liczby kopii plazmidu zgodnie ze wzorem (Nordström i Austin 1989r.) : PLAZMIDY: (1kb-1,7Mb) • małe • średnie • duże • megaplazmidy • jednokopiowe • niskokopiowe (2-8 kopii na komórkę) • wysokokopiowe P - prawdopodobieństwo powstania komórki bezplazmidowej (tzw. czystość segregacji plazmidu) n - liczba kopii plazmidu jeżeli n =2 komórki bezplazmidowe powinny pojawić się już po 2 podziałach, jeżeli n =20 częstość segregacji wynosi mniej niż 10 -6
LOSOWY ROZDZIAŁ PLAZMIDÓW DO KOMÓREK POTOMNYCH • od częstości segregacji zależy segregacyjna stabilność plazmidów • jest to wystarczające dla stabilnego dziedziczenia w przypadku plazmidów wysokokopiowych
LEPSZY NIŻ LOSOWY ROZDZIAŁ PLAZMIDÓW DO KOMÓREK POTOMNYCH W rzeczywistości nawet plazmidy o niskiej liczbie kopii są niezwykle trwale utrzymywane w populacjach bakteryjnych, niezależnie od braku presji selekcyjnej Istnieją specyficzne mechanizmy stabilnego dziedziczenia plazmidów: • System miejscowo specyficznej rekombinacji (wspomaga jedynie rozdział losowy plazmidów) • System aktywnego rozdziału (partycji) • Systemy post-segregacyjnego zabijania (addykcyjne)
SITE-SPECIFIC RECOMBINATION SYSTEMS • KATASTROFA DIMEROWA • Powstawanie dimerów lub form oligomerycznych wyższego rzędu wśród identycznych kopii plazmidów • problem z miejscami ori • częstsze niż oczekiwane powstawanie komórek bezplazmidowych • plazmidy kodują tzw. mrs (multimer resolution system) przeciwdziałający utrzymywaniu się form oligomerycznych w komórce • system ten tworzy miejscowo-specyficzna rekombinaza (resolwaza), która rozpoznaje tzw.sekwencje res
ACTIVE PARTITION Wspomagają fizyczny rozdział kopii plazmidów do komórek potomnych konieczne jest: • miejsce centromerowe • gen kodującego białko wiążące się do DNA rejonu centromerowego • gen o właściwościach ATP-azy • oba geny, kodujące odpowiednie białka (tworzące kompleks nukleoproteinowy) wchodzą w skład operonu, którego transkrypcja jest przez nie regulowana
PLASMID ADDICTION SYSTEMS (PSK) • Działają po podziale komórki, uzależniają komórkę gospodarza od występujących w niej plazmidów (addykcja) • nazywane systemami post- segregacyjnego zabijania (PSK), systemami trucizna - odtrutka, toksyna - antidotum (TA) • ideę addykcji zaproponował Koyama w 1975r. zauważając, ze jeśli komórka tracąca plazmid ginie, to w populacji nigdy nie znajdzie się pozbawionych plazmidów komórek potomnych
SYSTEMY ADDYKCYJNE (PSK) Trucizna jest białkiem, antidotum antysensownym RNA Trucizna i antidotum są białkami system ten tworzą przynajmniej dwa geny plazmidowe, warunkujące powstawanie: • stabilnej trucizny ( dłuższy okres półtrwania) • nietrwałego antidotum (krótki czasie półtrwania)
SYSTEMY PSK REGULOWANE PRZEZ ANTYSENSOWNY RNA • zbadane i opisane na przykładzie systemu hok-sok (host killing, supression of killing) znajdującego się na plazmidzie R1 E. coli • zawiera on trzy nakładające się geny : hok - kodujący toksynę mok - regulujący translację trwałego mRNA trucizny sok - kodujący nietrwały antysensowny RNA, komplementarny do obszaru 5’ mRNA mok-hok. • wysoką trwałość mRNA trucizny powoduje występująca na jego 3’ końcu strukturze fbi (fold back inhibition)
PROTEIN PLASMID ADDICTION SYSTEMS (PPAS) • dwa (lub trzy) geny stanowią operon • autoregulacja transkrypcji: antidotum samo lub w kompleksie z trucizna działa jako represor promotora
PROTEIN PLASMID ADDICTION SYSTEMS (PPAS) • podobieństwa strukturalne i funkcjonalne systemów • nie ma znaczących podobieństw sekwencji ich genów • małe białka (70-130aa) • białko trucizny na ogół większe od antidotum
PROTEIN PLASMID ADDICTION SYSTEMS (PPAS) Pomimo intensywnych badań prowadzonych przez ostatnie lata nad różnymi systemami trucizna - antidotum tylko dla nielicznych z nich udało się ustalić molekularny mechanizm działania trucizny
PLAZMID pSM19035 wyizolowany z patogennych komórek klinicznego szczepu Streptococcus pyogenes • plazmid niskokopiowy (ok. 2-5 cząsteczek plazmidu na chromosom bakteryjny) • plazmid o szerokim zakresie gospodarzy • replikuje (według schematu theta) w bakteriach Gram-dodatnich, w których zawartość par G+C w DNA chromosomalnym jest niska • koduje oporność na erytromycynę 28975bps • prawie 80% cząsteczki stanowią powtórzone sekwencje • w komórkach Bacillus subtilis plazmid wykazuje 1000 razy większą stabilność niż wynikałoby to z losowego rozdziału
PLASMID pSM19035 na plazmidzie tym zidentyfikowano dwa rejony zaangażowane w trzy różne procesy stabilnego dziedziczenia: Seg A, gen system miejscowo specyficznej rekombinacji. wymaga chromosomalnego histono - podobnego białka komórkowego Hbsu (w Bacillus subtilis) Seg B oraz -- . lepszy niż losowy rozdział plazmidów • genu aktywny rozdział plazmidów • operon -- proces post-segregacyjnego zabijania
SYSTEM -- PLAZMIDU pSM19035 Białko omega jest globalnym regulatorem funkcjonowania genów plazmidu pSM19035: • reguluje liczbę kopii plazmidu, działając na gen CopS • reguluje ekspresję genu i wpływa na aktywną partycję • jest represorem transkrypcji operonu -- • gen antidotum Epsilon (90aa) proteaza degradująca ClpXP • gen trucizna Zeta (287aa) • gen białko Omega (71aa)
OMEGA JAKO GLOBALNE BIAŁKO REGULATOROWE KONTROLA LICZBY KOPII AKTYWNA PARTYCJA SYSTEM PSK
SYSTEM -- PLAZMIDU pSM19035 • brak znaczącego podobieństwa do znanych sekwencji wśród sekwencji kodujących białka Zeta, Epsilon i Omega • jedyny dobrze rozpoznawalny motyw jest obecny w N-końcowym rejonie Zety i jest nim ATP/GTP wiążący motyw Walkera (P- loop) • wykorzystując drożdżowy system dwuhybrydowy wykazano wzajemne oddziaływanie Zety i białka Epsilon • analizując mutanty delecyjne powstałe wskutek ukierunkowanej mutagenezy genów i wykazano wzajemne oddziaływanie N- końca białka Epsilon i N-końca białka Zeta • udało się również wykrystalizować (Meinhart 2003r.) kompleks białek trucizny i odtrutki (Epsilon2Zeta2)
PRZYSZŁOŚĆ • Identyfikacja rejonu trucizny Zety odpowiedzialnego za toksyczne działanie • znalezienie celu dla działania trucizny WNIOSKI KOŃCOWE Niskokopiowe plazmidy o szerokim zakresie gospodarzy stanowią bardzo interesujący obiekt badawczy: • wektory, również jako wektory miedzy komórkami prokariotycznymi i eukariotycznymi • konstrukcje nowych leków antybakteryjnych • wykorzystanie plazmidowych systemów post segregacyjnego zabijania w walce z patogennymi drobnoustrojami (środki farmakologiczne nowej generacji)