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不同样品核酸提取、扩增、荧光定量 PCR 完美解决方案

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不同样品核酸提取、扩增、荧光定量 PCR 完美解决方案

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  1. 不同样品核酸提取、扩增、荧光定量PCR完美解决方案不同样品核酸提取、扩增、荧光定量PCR完美解决方案 http://www.bioteke.com E-mail: info@bioteke.com Fax：010-62951781 Tel：010-62951781 62983458 62979408 北京百泰克生物技术有限公司（北京市海淀区上地信息路15号）

  2. 不同样品核酸提取、扩增、荧光定量PCR完美解决方案不同样品核酸提取、扩增、荧光定量PCR完美解决方案 ---核酸提取攻略 北京百泰克生物技术有限公司（北京市海淀区上地信息路15号）

  3. 内容概要 • 不同样品RNA提取最适方法 • RNA纯度与质量考察 • RNA提取常见问题及解决方案 • 常见样品DNA提取 • 特殊样品DNA提取 • DNA分离纯化中常见问题分析

  4. RNA提取流程 酒精沉淀 或介质吸附 样品 裂解液 液氮研磨 或其他方法处理 抽提 离心洗涤 干燥溶解 或洗脱 细胞裂解 上层溶液

  5. RNA提取常用方法---沉淀方法 • 沉淀法：异丙醇或乙醇 • 介质吸附法：

  6. RNA提取常用方法---裂解方式 异硫氰酸胍/苯酚法 • 在变性剂异硫氰酸胍的作用下，细胞被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放； • 释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离； • 有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNA。 胍盐 /β-巯基乙醇 • 盐酸胍裂解样本 ，抑制 RNase 的活性 ； • β-巯基乙醇变性蛋白

  7. BioTeke的RNA提取试剂具有明显的优势 • 在经典试剂的基础上，不断升级。 • 多款高品质的RNA提取试剂： • Tri pure （Trizol） • RNApure（Trizol法的升级产品）

  8. 组织/细胞样品RNA提取 • 材料： • 小鼠肝脏组织 • 方法： • BioTekeRNApure高纯总RNA • 快速提取试剂盒 • 0.1g样品组织 • 结果： 1 2 3 4 图：小鼠肝脏组织RNA

  9. RNApure 高纯总RNA快速提取试剂 1 2 3 图片说明： 1 BioTeke RNAclean 2 BioTeke TRIpure (TRIzol法) 3 BioTeke RNApure 离心柱型 (注：本图实验材料为植物叶片）

  10. 同一样品基因组DNA和RNA分提 原理： 根据基因组DNA和RNA在硅基质膜上的结合条件不同，用两根离心吸附柱分别提取基因组DNA和RNA。

  11. 特殊样品RNA提取---血液 图1全血样品溶解在TRI pure LS Reagent试剂后的状态 图2泳道1与2，在-80度保存一个月后的提取结果。M泳道：标准的Hela细胞RNA

  12. 多糖多酚植物样品RNA的提取 • 材料： • 松针、冬青、香蕉、木菠萝和杨树 • 方法： • 通用植物总RNA提取试剂盒 • （离心柱型） • 0.1g样品组织 • 结果： • 得率：约35-40μg • 纯度：OD260/OD280＝1.82-1.95 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 试剂盒适用范围： 水稻种子、小麦种子、玉米种子、高粱种子、拟南芥种子、大豆种子、苹果、葡萄、香蕉、棉花、龙眼、荔枝、各种草坪牧草植物、各种树木、各种花卉等绝大多数植物 图片说明：1、2 杨树；3、4 香蕉；5、6 松针；7、8 冬青；9 、10 木菠萝

  13. Micro RNA提取 • 提取原理： • 传统方法：先提取总RNA然后跑胶回收或沉淀Micro RNA。 • 新方法：通过裂解液裂解和酸酚分层后过柱两次，一次去除基因组DNA和大片段RNA，后一次吸附Micro RNA，然后漂洗收集。 1 2 3 4 • 新方法特点： • 高效分离小RNA，同时分离总RNA • 可用于miRNA、siRNA和snRNA的分析 • 适用各种来源的样品 • 提取时间短，约30分钟完成实验 图片说明：1、2DNA和大RNA；3、4Micro RNA (材料为小鼠肝脏组织)

  14. RNA纯度与质量考察 • 生物大分子具有共轭双键，在260和280nm波长处有光吸收峰。 • 纯度：紫外分光光度计测定所提总RNA在260nm和280nm波长处的光吸收，以A260/A280的比值来判断总RNA的纯度。 • 质量：甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定。

  15. RNA提取常见问题及解决方案 • RNA 的降解 • OD260 /OD280 比值偏低 • 电泳带型异常 • 下游实验效果不佳

  16. RNA的降解 • 新鲜细胞或组织： • 裂解液的质量 • 外源RNase的污染 • 裂解液的用量不足 • 组织裂解不充分 • 另外某些富含内源酶的样品 (如脾脏，胸腺等)，很难避免 RNA 的降解。 • 建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用更多裂解液。

  17. RNA的降解 • 冷冻样品： • 样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至-70℃冰箱保存。样品要相对小一点； • 先用液氮研磨，再加裂解液匀浆； • 样品与裂解液充分接触前避免融化，研磨用具必须预冷，研磨过程中及时补充液氮。

  18. RNA的保护 • 采集样品的保护： • 通常用液氮保存 • 样品保护剂RNAfixer,样品浸泡其中可以在37℃保存一天，25℃一周，4℃一个月，-20℃一年左右。 • 环境中RNase的清除： • DEPC处理各种实验器具 • RNAsafe对溶液中RNase进行清除。 • RNA酶喷雾清除剂，可对固体表面的RNase起到清除的作用，更大程度上避免RNase的污染。

  19. OD260 /OD280 比值偏低 蛋白质污染： • 不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。 • 减少起始样品量，确保裂解完全、彻底 • 解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。 苯酚残留： • 不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。 • 解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。

  20. OD260 /OD280 比值偏低 抽提试剂残留： • 确保洗涤时要彻底悬浮 RNA，并且彻底去掉 75% 乙醇。 • 解决办法:再沉淀一次后，溶解。 • 设备限制： • 测定OD260 及OD280 数值时，要使OD260 读数在 0.10 - 0.50 之间。此范围线性最好。 用水稀释样品： • 测 OD 时，对照及样品稀释液请使用 10 mM Tris，pH 7.5。用水作为稀释液将导致比值的降低。

  21. 电泳条带异常 非变性电泳： • 上样量超过 3μg，电压超过 6V/cm，电泳缓冲液陈旧，均可能导致 28S 和 18S 条带分不开。 • 变性电泳条带变淡： • EB 与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量，变性电泳比非变性电泳要淡一些； • 甲醛的质量不高 。

  22. 抽提试剂的残留 • 75% 乙醇洗涤 • 样品中杂质的残留 • 多糖等杂质，再次沉淀 • DNA 污染 • 使用RNase-Free 的 DNase I 消化抽提RNA 下游实验效果不佳（RNA降解）

  23. 不同样品基因组DNA提取 • 常见样品基因组DNA提取 • 细胞/组织/细菌/血液基因DNA提取 • 植物材料DNA提取 • 特殊样品基因组DNA提取 • 大量血液样品DNA提取 • 环境微生物DNA提取 • 临床样本DNA提取 • DNA分离纯化中的常见问题分析

  24. 基因组DNA提取流程

  25. 基因组DNA提取流程-细胞裂解 • 化学方法 • CTAB法：适用于植物材料等。是一种阳离子去污剂，溶解细胞膜，与核酸结合。在高盐下溶解释放DNA。 • SDS法：适用于血液，细胞，动物组织，细菌，酵母等 • 物理方法 机械剪切，超声波破碎，研磨匀浆等。易造成DNA断裂。 • 酶法 蛋白酶K BioTeke基因组DNA提取系列试剂盒综合利用上述方法

  26. 组织/细胞/细菌/血液基因组DNA提取 提取原理： • 特点： • 不需要使用有毒的氯仿、苯酚等试剂 • 多次柱漂洗确保高纯度；长度可达30-50Kb

  27. 植物材料基因组DNA提取 提取原理： 玉米叶片基因组DNA提取 （使用新型快速植物基因组DNA提取试剂盒）

  28. 特殊样品基因组DNA提取 传统方法适用于所有材料基因组DNA的提取？ 比如大量血液？ 比如土壤/粪便中的微生物基因组DNA的提取？ 比如病毒及其他微量样品DNA的提取？ NO！

  29. 中量/大量血液基因组DNA提取 • 传统方法 • 消化后，用酚/氯仿抽提， • 时间长，损害操作人员健康 • BioTeke创新 • 不用蛋白酶消化 • 不用酚/氯仿抽提 • 结果： • 得率：约75-250μg /5mL血样 • 纯度：OD260/OD280＝1.87-1.95 5ml全血基因组DNA提取电泳结果

  30. 土壤/粪便微生物基因组DNA提取 • 其他品牌试剂盒存在缺点： • 采用玻璃珠或钢珠破碎，导致基因组断裂严重； • 必须购买破碎专用设备，增加使用成本； • 采用包括玻璃奶、离心吸附柱串联的纯化方式，导致DNA大量损失，得率很低，很难真实反映土壤微生物的多样性。 • BioTeke的技术创新： • 采用酶法破碎，保证基因组的完整性； • 用异丙醇沉淀DNA，DNA无损失。

  31. 临床样品基因组DNA提取 • 病毒基因组DNA提取 • 酵母基因组DNA提取 • 口腔拭子DNA提取 • 微量样品DNA提取 • 石蜡组织DNA提取 • 头发DNA提取

  32. 一步法DNA提取扩增 原理： 综合微量样品基因组DNA提取和高效的PCR扩增试剂。从毛发、石蜡组织等微量组织中高效提取足够浓度的DNA，然后进行PCR扩增。操作简单、方便，可对大量样品同时进行操作。

  33. 基因组DNA分离纯化中的注意事项 • 保证基因组DNA的完整性和纯度 • 提高DNA的洗脱效率 • DNA的储存

  34. 基因组DNA分离纯化中的注意事项 • 保证基因组DNA的完整性和纯度 • 提高DNA的洗脱效率 • DNA的储存 • 简化操作步骤，缩短操作时间 • 减少物理因素对DNA的降解，震荡、搅拌等 • 减少化学物质对DNA的降解，操作多在pH4-10 • 防止基因组DNA的生物降解：DNase

  35. 基因组DNA分离纯化中的注意事项 • 保证基因组DNA的完整性和纯度 • 提高DNA的洗脱效率 • DNA的储存 • 洗脱液65度预热10分钟 • 洗脱体积不小于30μL • 洗脱2次或者3次

  36. 基因组DNA分离纯化中的注意事项 • 保证基因组DNA的完整性和纯度 • 提高DNA的洗脱效率 • DNA的储存 • 可长期储存于pH=7.0的ddH2O或TE • 不易制成干品储存 • 分装低温保存

  37. 如何提高微量核酸提取或回收后的浓度 • 核酸助沉剂的应用 • 微量吸附柱的应用---15μl洗脱体系 • 质粒提取 • 胶回收或PCR产物回收 • 微量细胞/组织DNA/RNA提取 • 病毒DNA/RNA提取 • 微量临床样本DNA/RNA提取

  38. 不同样品核酸提取、扩增、荧光定量PCR完美解决方案不同样品核酸提取、扩增、荧光定量PCR完美解决方案 ---Real-time qPCR攻略 北京百泰克生物技术有限公司（北京市海淀区上地信息路15号）

  39. 主要内容 • RT-PCR原理 • Real-time qPCR原理及应用 • Real-time qPCR成功关键 • Real-time qPCR数据分析 • Real-time qPCR常见问题及解决方案

  40. 中心法则与RT、PCR PCR DNA RT RNA

  41. 反转录相关因素 • 逆转录反应可以以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始。 • 提取RNA的质量会影响到RT的产量及cDNA的完整性。 • 整个过程要求无RNA酶操作。 • 反转录酶、RNA酶抑制剂都会对产物的质量造成一定的影响。

  42. Super M-MLV反转录酶 • 高效的逆转录活性，且无RNaseH活性 • Thermo M-MLV反转录酶 • 高效的逆转录活性，且无RNaseH活性 • 适合合成长片段的cDNA,有很强的模板兼容性，对高GC含量（75%以上）和结构复杂的模板效果显著 • 在42℃-60℃具有较好的热稳定性。

  43. One step RT-PCR 模板： 使用BioTeke公司的RNApure 总RNA提取试剂盒提取的鸡肝脏组织RNA 目的片段：管家基因β-Actin 反应体系： 反应程序：

  44. RT-PCR相关产品 反转录酶及试剂盒系列产品讲座期间特价优惠！ Super M-MLV反转录酶，10000u/198元 Super RT Kit cDNA 第一链合成试剂盒50次，特价490元 Super One-step RT-PCR Kit 一步法RT-PCR试剂盒50次，特价880元 Thermo 系列产品买二赠一！ Thermo M-MLV反转录酶，10000u/580元 Thermo RT Kit cDNA 第一链合成试剂盒50次，价格1200元 Thermo One-step RT-PCR Kit 一步法RT-PCR试剂盒50次，价格1400元

  45. RT-PCR原理 • Real-time qPCR原理及应用 • Real-time qPCR成功关键 • Real-time qPCR数据分析 • Real-time qPCR常见问题及解决方案

  46. 实时荧光定量PCR技术的应用 • 基因表达差异分析 • 拷贝数分析 • SNP检测 • miRNA定量 • 转基因成分定量分析 • 临床诊断、疾病及药物研发等

  47. Real-time qPCR原理 • 如何对初始模板定量 • 荧光信号如何产生？

  48. 实时定量PCR 化学原理 两个重要图形 非探针 探针 扩增曲线 熔解曲线 Real-Time qPCR主要概念

  49. Real-Time qPCR曲线的意义 扩增曲线 熔解曲线 图片为：首都医科大学演示实验结果 材料：小鼠肝脏 基因：β-actin

  50. 荧光染料和荧光探针 实时荧光定量 PCR 的化学原理包括探针类和非探针类两种。 • 非探针类则是利用荧光染料（如SYBR Green I）或者特殊设计的引物(如LUX Primers)来指示扩增的增加。 • 探针类(TaqMan探针和分子信标)是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加。 • 后者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但前者则简便易行。

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