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尖孢镰刀菌多态性及枯萎病 植物疫苗工程菌的研究

尖孢镰刀菌多态性及枯萎病 植物疫苗工程菌的研究. 姓 名：詹 洪 导 师：刘 波 博士、研究员. 福建农林大学 ， 福建省农业科学院 2013 年 05 月 30 日. 报告内容. FOF1/FOR1. 研究背景 技术路线 研究内容 总结与展望 发表文章 致谢. 大型分生孢子. 小型分 生孢子. 一、研究背景.

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尖孢镰刀菌多态性及枯萎病 植物疫苗工程菌的研究

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Presentation Transcript

  1. 尖孢镰刀菌多态性及枯萎病 植物疫苗工程菌的研究 姓 名：詹 洪 导 师：刘 波 博士、研究员 福建农林大学，福建省农业科学院 2013年 05月 30日

  2. 报告内容 FOF1/FOR1 • 研究背景 • 技术路线 • 研究内容 • 总结与展望 • 发表文章 • 致谢 大型分生孢子

  3. 小型分 生孢子 一、研究背景 • 尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum Schl.）属半知菌类(Imperfecti fungi)、从梗孢目(Moniliales)、瘤座孢科(Tuberculariaceae)、镰刀菌属(Fusarium)。 厚垣 孢子

  4. 一、研究背景 致病性尖孢镰刀菌 • 侵入植物的维管束系统 • 100个科 • 作物减产10-60% • 化学土壤熏蒸或者培育抗病品种 • 生物防治

  5. 生物 防治 一、研究背景 非致病性尖孢镰刀菌 • 可在植物中定植但不引起发病 • 对致病性尖孢镰刀菌有拮抗作用 • 生物防治 • FO47用于防治多种蔬菜、花卉枯萎病

  6. 一、研究背景 FJAT-9290 • 本实验室保存的非致病性尖孢镰刀菌FJAT-9290，可在多种作物中安全定殖，对番茄盆栽苗有明显的促长作用，且对其枯萎病的防效达76%

  7. 培养时间 pH 二、技术路线 温度 营养条件 ISSR遗传多态性 致病性菌株的 多态性 脂肪酸生物标记多态性 尖孢镰刀菌 植物疫苗工程菌的生物学特性 西瓜 植物疫苗工程菌 对枯萎病的防效 香蕉

  8. 三、研究内容 • 尖孢镰刀菌致病菌株的ISSR遗传多态性 • 尖孢镰刀菌致病菌株的脂肪酸生物标记多态性 • 枯萎病植物疫苗工程菌（尖孢镰刀菌非致病性菌株FJAT-9290） • 的生物学特性 • 4. 枯萎病植物疫苗工程菌（尖孢镰刀菌非致病性菌株FJAT-9290） • 对枯萎病的防效

  9. PCR循环参数： • 94 ℃，5 min； • 94 ℃，45 s； • 52 ℃/54℃，45 s； • 72 ℃，2 min； • 72 ℃，7 min； 三、研究内容 1.尖孢镰刀菌致病菌株的ISSR多态性 35 （1）ISSR引物的筛选 • PCR反应体系： • 30 mmol MgCl2; • 3 mmol dNTP; • 8 μmol引物; • 1.0 U Taq DNA聚合酶; • 20 ng 模板DNA; • 筛选出15条背景清晰、信号强、多态性明显的引物

  10. 三、研究内容 1.尖孢镰刀菌致病菌株的ISSR多态性 （2）尖孢镰刀菌ISSR引物扩增结果 • 扩增出165条条带，其中特征性条带163条，多态性平均比例98.8%。 • 尖孢镰刀菌DNA 基因组的SSR 区域的遗传差异明显、多态性高，表明ISSR 标记技 • 术用于分析尖孢镰刀菌种内遗传差异十分有效。

  11. 三、研究内容 1.尖孢镰刀菌致病菌株的ISSR多态性 （3）瓜类尖孢镰刀菌ISSR多态性分析 • 当遗传相似系数为0.84时，可分为6类。可将不同寄主与地理分布的菌株区分开。 • （1）甜瓜寄主3类，分别为采自福州闽候、莆田和福州永泰。 • （2）苦瓜寄主1类，均来自福州闽候。 • （3）西瓜寄主2类，分别为采自福州永泰和福清。 图 瓜类尖孢镰刀菌ISSR多态性

  12. 三、研究内容 1.尖孢镰刀菌致病菌株的ISSR多态性 （4）茄科尖孢镰刀菌ISSR多态性分析 • 当遗传相似系数为0.77时，可分为6类。可将不同寄主与地理分布的菌株区分开。 • （1）番茄寄主2类，分别为来自浙江、福州和河北。 • （2）辣椒寄主3类，来自福州漳州、莆田和福清。 • （3）茄子寄主1类，来自厦门。 图 茄科尖孢镰刀菌ISSR多态性

  13. 三、研究内容 2.尖孢镰刀菌致病菌株的脂肪酸生物标记多态性 （1）脂肪酸生物标记聚类分析 λ=15.97 • 类群Ⅰ完全分布型脂肪酸。 • 类群Ⅱ不完全分布型脂肪酸。 • 类群Ⅲ偶现脂肪酸，仅在瓜类尖孢镰刀菌中出现。 • X1-- 16:0；X2--16:1 cis 9 (w 7)；X3--20:0； X4--18:0；X5--iso 17:1 G (w 11)； • X6--15:0； X7--14:0； X8--15:0 ANTEISO；X9--15:0 iso； • X10--Feature 8 | 18:1 (w 8) | 18:1 cis 9 (w 9)；X11--18:2 cis 9,12/18:0a。

  14. 三、研究内容 λ=13.5 2.尖孢镰刀菌致病菌株的脂肪酸生物标记多态性 （2）瓜类尖孢镰刀菌脂肪酸生物标记多态性 马氏距离，可变类平均法。 当λ=13.5时，可分为3类。可将不同寄主的菌株区分开。 （1）第1类为甜瓜寄主。 （2）第2类主要为苦瓜寄主。 （3）第3类为西瓜寄主。 • 尖孢镰刀菌脂肪酸生物标记为指标的进化过程，来自苦瓜的尖孢镰刀菌起着在甜瓜和花生的尖孢镰刀菌之间的过渡性进化作用。

  15. 三、研究内容 2.尖孢镰刀菌致病菌株的脂肪酸生物标记多态性 （3）茄科尖孢镰刀菌脂肪酸生物标记多态性 λ=12.54 • 从聚类分析的结果可以看出，尖孢镰刀菌脂肪酸生物标记为指标的进化过程，茄科尖孢镰刀菌未表现出明显的寄主分化。 马氏距离，可变类平均法。 当λ=12.54时，可分为3类。可将不同寄主的菌株区分开。 （1）第1类主要为番茄寄主。 （2）第2类主要为茄子寄主。 （3）第3类为辣椒寄主。

  16. 三、研究内容 3.植物疫苗工程菌（尖孢镰刀菌非致病性菌株FJAT-9290）的生物学特性 （1）培养时间对菌株生长的影响 • 菌丝干重、pH值与致病菌株无显著差异； • 产孢量：非致病菌株<致病菌株； • 还原糖含量：非致病菌株下降快； 产孢量 菌丝干重 pH值 还原糖含量

  17. 三、研究内容 3.植物疫苗工程菌（尖孢镰刀菌非致病性菌株FJAT-9290）的生物学特性 （2）培养pH值对菌株生长的影响 • pH=8时菌丝生长最快 • pH=7时菌株产孢量最大 • 偏碱性环境有利于菌株的菌丝生长。

  18. 25 ℃时菌株的生长速率最快 三、研究内容 3.植物疫苗工程菌（尖孢镰刀菌非致病性菌株FJAT-9290）的生物学特性 （3）培养温度对菌株生长的影响 • 30 ℃时菌株的产孢量最大

  19. 三、研究内容 3.植物疫苗工程菌（尖孢镰刀菌非致病性菌株FJAT-9290）的生物学特性 （4）营养成份（碳源）对菌株生长的影响 • 淀粉最利于非致病性菌株FJAT-9290菌丝生长；致病性菌株FJAT-282 对碳源的变化不敏感。 • 葡萄糖和蔗糖最利于非致病性菌株FJAT-9290产孢；果糖最利于致病菌菌株FJAT-282产孢。

  20. 三、研究内容 3.植物疫苗工程菌（尖孢镰刀菌非致病性菌株FJAT-9290）的生物学特性 （4）营养成份（碳源）对菌落形态的影响 FJAT282、蔗糖 FJAT282、木糖 FJAT-9290、蔗糖 FJAT-9290、果糖 • 菌株FJAT-9290的菌落分为两类：蔗糖（淀粉、山梨醇）；果糖（木糖、葡萄糖）。 • 菌株FJAT-282的菌落形态分为两类，蔗糖（淀粉、山梨醇、果糖）；木糖（葡萄糖）。 FJAT-9290、果糖

  21. 三、研究内容 3.植物疫苗工程菌（尖孢镰刀菌非致病性菌株FJAT-9290）的生物学特性 （4）营养成份（氮源）对菌株生长的影响 • 蛋白胨、牛肉膏、硝酸钠最有利于非致病性菌株FJAT-9290菌丝的生长。 • 硝酸钠最有利于非致病性菌株FJAT-9290的产孢。

  22. 三、研究内容 3.植物疫苗工程菌（尖孢镰刀菌非致病性菌株FJAT-9290）的生物学特性 （4）营养成份（氮源）对菌落形态的影响 FJAT-282 蛋白胨 FJAT-282 赖氨酸 FJAT-282 硫酸铵 FJAT-9290 硫酸铵 FJAT-9290 蛋白胨 FJAT-9290 赖氨酸 • 菌株FJAT-9290在不同氮源培养基上的形态差异较大，体现在菌落的颜色、大小、厚薄、菌丝的致密程度。 • 菌株FJAT-282在不同氮源培养基上的形态差异体现在菌丝的稠密程度，及菌落的厚度。

  23. 三、研究内容 处理2 处理3 处理4 处理1 处理6 处理5 4.植物疫苗工程菌（尖孢镰刀菌非致病性菌株FJAT-9290）的生物防效 （1）对西瓜枯萎病的生防效果 • 先接FJAT-9290，7 d后接致病性菌株FJAT-30265的防治效果最好，防效达62.96%。 • 处理1：FJAT-9290 • 处理2：FJAT-9290－FJAT-30265 • 处理3：FJAT-9290＋FJAT-30265 • 处理4：FJAT-30265－FJAT-9290 • 处理5：FJAT-30265 • 处理6：清水对照

  24. 三、研究内容 4.植物疫苗工程菌（尖孢镰刀菌非致病性菌株FJAT-9290）的生物防效 （2）对香蕉盆栽苗的生长影响 • 不同处理香蕉苗的叶片数和株高均为：处理1＞处理6＞处理2＞处理3＞处理4＞处理5 • 处理1：FJAT-9290 • 处理2：FJAT-9290－FJAT-370 • 处理3：FJAT-9290＋FJAT-370 • 处理4：FJAT-370－FJAT-9290 • 处理5：FJAT-370 • 处理6：清水对照

  25. 处理1 处理4 三、研究内容 处理2 处理5 处理3 处理6 4.植物疫苗工程菌（尖孢镰刀菌非致病性菌株FJAT-9290）的生物防效 （3）对香蕉枯萎病的生防效果 • 先接FJAT-9290，7 d后接致病性菌株FJAT-370的防治效果最好，防效达75%。

  26. 四、结论与展望 结论 • ISSR分子标记技术可将不同寄主与地理来源的尖孢镰刀菌致病性菌株区分开。脂肪酸生物标记可用于区分不同寄主来源菌株，但无法区分不同地理来源的菌株。 • 植物疫苗工程菌FJAT-9290在pH=7-8、温度25-30℃时适宜生长，碳源对菌丝生长敏感，产孢量较不敏感，对菌落形态影响较小；氮源中硝酸钠最有利于菌株的生长，氮源对菌落形态的影响较大。 • 植物疫苗工程菌FJAT-9290对西瓜与香蕉枯萎病的预防接种的盆栽防效分别为62.96%和75.00%。

  27. 四、结论与展望 展望 • 尖孢镰刀菌的表型特征及遗传多样性的研究均证明，其致病性菌株存在明显的菌株多样性及致病性分化，所以深入了解菌株的遗传多样性和致病性分化，对该病害的防治具有重要的意义。枯萎病因其重要性及危害性，其防治受到很大的重视。非致病性尖孢镰刀菌作为生物防治中的重要因子，要发挥良好的生物防治潜能，除了通过剂型提高其产品的生防效果外，还需结合自然环境中的微生态环境进行分析，以期达到最佳的生防效果。

  28. 五、发表文章 • 个人简介 • 姓 名：詹洪 • 毕业院校：福建农林大学 • 专 业：微生物学 • 詹洪, 刘波, 肖荣凤. 枯萎病植物疫苗工程菌FJAT-9290生物学特性的研究[J]. 福建农业学报.（投稿中） • 实验报告： 64篇

  29. 六、致谢 • 首先诚挚的感谢我的指导老师——刘波研究员，他严肃的科学态度，严谨的治学精神，精益求精的工作作风，深深地感染和激励着我。在这段宝贵的时光中，我既增长了知识、开阔了视野、锻炼了心态，又培养了良好的实验习惯和科研精神。在此，我向刘波老师表示最诚挚的谢意！ • 同时还要感谢我的副导师——肖荣凤老师，在整个实验和论文写作过程中，肖荣凤老师对我进行了耐心的指导，为我答疑解惑，不厌其烦的帮助我修改论文；感谢实验室的师兄师姐们，感谢他们在我刚进入实验室时对我的无私关怀；还有我同届的同学们，共同努力营造一个和谐的实验环境，大家彼此谦让共同努力。 • 感谢我的父母和弟弟，在我疲惫的时候是他们无私的爱，鼓励支持着我前进。最后再一次感谢所有在实验和论文中曾经帮助过我的良师益友和同学，以及在设计中被我引用或参考的论著的作者。

  30. 谢 谢！

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