第三节 染色体自主复制序列的 分离与鉴定

1. 第三节 染色体自主复制序列的 分离与鉴定

2. 一．分离ARS的一般程序 染色体DNA→限制酶切→与整合型载体连接→转化相应的宿主细胞→分离纯化转化体*→分离各转化子总DNA→转化E.coli→药物抗性菌落→分离质粒DNA→重新转入宿主细胞→高频重组转化体 *在获得第一次转化体后，可利用下述方法淘汰掉全部因整合作用所形成的转化体：

3. 转化体菌落→点种在合成和完全培养基上的同一位置→培养→将完全培养基平板上的菌落影印到另一个合成培养基平板上→培养→比较两个合成培养基平板上生长的菌落，挑选那些在第二个合成培养基平板上不生长的相应位置上的菌落（从第一个平板上挑取）转化体菌落→点种在合成和完全培养基上的同一位置→培养→将完全培养基平板上的菌落影印到另一个合成培养基平板上→培养→比较两个合成培养基平板上生长的菌落，挑选那些在第二个合成培养基平板上不生长的相应位置上的菌落（从第一个平板上挑取） 二．ARS的分析与鉴定 1．限制酶谱与次克隆 2. 倒位分析

4. 3. 插入分析：将1.4Kb EcoRI片段分离出来，插入另一个整合载体，其重组DNA分子的转化频率可大大提高 4. 定位分析

5. 5. 遗传稳定性分析 6. DNA序列分析 用ARS DNA作探针与染色体DNA杂交，只能有一杂交带出现，这表明各ARS顺序之间不能发生交叉杂交，但不同的ARS显然只能利用同种DNA聚合酶。 核苷酸顺序测定结果表明，来自不同的ARS顺序含有11个核苷酸的保守序列： A(T) TTTATA(G)TTTA(T) AT含量几乎为100% 该保守序列位于一富含AT的区域内，其长度为100 bp，AT含量为79%。ARS1的结构分析表明，它由两个组件构成。组件A决定高频转化，但自由复制有限，而组件B可提高组件A的复制效率，但它本身不能自主复制。 *利用上述方法分离自不同生物的ARS，当放回原来生物时不一定能自主复制

6. 第四节 着丝粒DNA的分离与鉴定

7. 一．分离着丝粒的方法与步骤 1. 染色体巡查法 先利用遗传互补法和免疫筛选法分离靠近着丝粒的各个基因，然后用染色体巡查的方法去筛选那些在有丝分裂和减数分裂中十分稳定的重组质粒，这种方法特别适合于那些遗传学图谱已经清楚的着丝粒的分离，其一般过程如下: 遗传互补法 染色体DNA→组建基因文库 分离与着丝粒两端或与着丝粒连锁 免疫筛选法 的基因 →染色体巡查→检测各重组DNA分子的遗传稳定性→进一步确证与鉴定 酵母染色体3、4、6和11上的着丝粒就是利用该法分离到的

8. 2.直接筛选法 该法适用于那些着丝粒与已知基因相距较远的或连锁关系不太清楚的着丝粒的分离。这种分离方法所依赖的原理之一是当一自主复制型载体插入一段含着丝粒的DNA片段后，其稳定性大大增加，而质粒的拷贝数将降为1-2。其分离程序： 染色体DNA→部分限制酶切→与自主复制载体相连→转化相应突变体→转化体→培养在完全培养基上→涂布在合成培养基上→纯化转化体→分离总DNA→转化E.coli→抗性转化体→分离质粒DNA→DNA杂交→进一步鉴定 ↓ 限制酶切→电泳→Southern杂交 酿酒酵母的CEN5便是利用此方法分离到的, 该法也适用于任何着丝粒DNA的分离。

9. 二．着丝粒DNA的鉴定方法 1. 稳定性分析 1) 有丝分裂：培养在完全培养基上若干代后再检测其质粒的的存在。 2) 减数分裂： 转化体细胞与另一性别细胞交配形成二倍体，然后再经孢子形成过程产生单倍体，从单倍体性状的分布情况就可得知分离到的着丝粒的特征(4+：0-，3+：1-，2+：2-，1+：3-） 2. 着丝粒在染色体上的定位 利用方法二所分离到的着丝粒常常需要确定它来自何条染色体, 而用方法一所得的着丝粒也要作进一步确证。定位方法所依据的原理之一是当一着丝粒侧的DNA与一标记基因连接后转化酵母细胞, 该DNA可以借助于与染色体同源序列插入到染色体中，从而导致原染色体中基因连锁关系发生变化。

10. 如何检测出该DNA插入到那条染色体中，可用下述方法: 1) 2μ染色体丢失作图法（2μ chromosome-loss mapping technique） 已有实验表明：当一条染色体上携带着2μ质粒DNA时，可能导致两种结果产生：①整条染色体丢失；②有丝分裂的纯性化，即远端与插入的遗传标记发生重组，从而导致两者间的DNA片段丢失。在二倍体中，这种现象的发生常常导致隐性标记基因的出现。 1.3 Kb SalI-BglⅡ片段 + YEp24→YEp24/1.3→BamHI酶切→线状DNA→转化酵母（Ura-）→Ura+转化体→选择稳定转化体→核酸杂交（pBR322为探针） ↓ 与具不同表型菌株交配→二倍体→完全培养基上15-20代→涂布在完全培养基上→影印到无尿嘧啶合成培养基上→Ura- 二倍体→检测其它缺陷型基因

11. 当上述片段经过这个方法检测后发现 his1出现，表明该片段位于染色体V上。 2)四分体分析（tetrad analysis） 1.3Kb SalI-BglⅡ片段 + pSZ57→pSZ57/1.3→BamHI酶切→线状DNA→转化酵母（Leu -）→选择稳定Leu+ 转化子→核酸杂交 ↓ 与不同表型菌株交配→二倍体→孢子形成→分离孢子→检查表型 LEU2总是与ura3和his1连锁在一起，而后两个基因位于第五条染色体上。

12. 第五节 端粒DNA的分离与鉴定

13. 一.四膜虫(Tetrahymena)rDNA的端粒结构 四膜虫中存在着许多线状的染色体外DNA。由于这种DNA分子携带着rRNA基因，因而称之为rDNA。每个单倍体细胞含有200个拷贝，每个rDNA的长度为21Kb。这种DNA具有以下对称结构：

14. 如何检测端粒的这种结构? 方法一：rDNA +E.coli DNA polI + dNTP（一种dNTP带标记）→不同限制酶切→凝胶电泳→放射自显影 方法二：rDNA +E.coli DNA polI +一种[α-32P] dNTP 只有使用[α-32P] dCTP时才能掺入到DNA链中去。 二. 线状质粒的构建 →转化Leu-酵母菌株 →Leu+转化子 → 分离非稳定转化子 → 分离转化子中质粒和鉴定 → 检测末端结构 → 线状质粒pSZ216可用于酵母端粒DNA片段的分离

15. pSZ216 7.4Kb片段（含LEU2基因） 重组分子 →转化酵母细胞（Leu -） 酵母DNA DNA片段 →Leu +转化体→不稳定转化体→分离线状质粒DNA→分析大小，凡是插入片段小于4.2 Kb片段可能是端粒DNA→利用带标记的dCTP(或其它dNTP) 检测是否具有典型的端粒结构→进一步鉴定 PvuI PvuI 三. 酵母端粒的分离与鉴定 如果一线状质粒DNA只含有一个端粒，当此DNA转入宿主细胞后，其结果是形成环状DNA或插入染色体DNA。