1 / 24

ELISA

ELISA. HIV infekcijas pierādīšanas eksperiments. HIV antivielu pierādīšana asinīs. Skolotāja sagatavošanās eksperimentam. 1. Buferšķīdumu sagatavošana. Mazgājošais buferšķīdums (900 ml) 805 ml H 2 O dest. + 90 ml PBS (10x) + 4,5 ml Tween 20

hye
Download Presentation

ELISA

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript


  1. ELISA HIV infekcijas pierādīšanas eksperiments. HIV antivielu pierādīšana asinīs

  2. Skolotāja sagatavošanās eksperimentam

  3. 1. Buferšķīdumu sagatavošana • Mazgājošais buferšķīdums (900 ml) 805 ml H2Odest.+ 90 ml PBS (10x) + 4,5 ml Tween 20 Mazgājošais buferšķīdums nepieciešams antivielu šķīduma atšķaidīšanai un mikrotitrēšanas stobriņu mazgāšanai. • Tween 20 satur BSA buferšķīdumu ,kurš bloķēs brīvās proteīna virsmas molekulas. • PBS-buferšķīdums (100 ml) • 90 ml H2Odest. + 10 ml PBS buferšķīdums (10x) • PBS-bufferšķīdums nepieciešams hidrofīlo antigēnu un antivielu rehidratācijai.

  4. 2. Rehidratācija ! • Atskrūvējiet korķi antivielu un antigēnu šķīdumu traukiem! • Iepiliniet pa 0,5 ml atšķaidīto PSBbufer šķ. antigēnu un primāro un sekundāro antivielu traukos! • Aizskrūvējiet traukus ar korķiem un kratiet ap 2 min.! Visi darba šķīdumu krājumi ir 50 x koncentrētāki!

  5. 3. Etiķetes uzlīmēšana • Marķējiet ar etiķetēm polifenola pudeles: • Antigēns • Primārā antiviela • Sekundārā antiviela Antigēns

  6. Skolēnu sagatavošanās eksperimentam 8 darba grupām Reaģentu daudzums ir pietiekošs 8 darba grupām 3 eksperimentiem! (3 x 160 µl kopējais reaģentu patēriņš = 480 µl; 500 µl -pudeles tilpums )

  7. Stobriņa krāsa Apzīmējums Stobriņu saturs Tilpums zaļš AG antigēns 800 µl oranžs sAB Sekundārā antiviela 800 µl brūns SUB substāts 800 µl violēts pAV Primārā antiviela 120 µl zils M B Mazgājošais buferšķīdums 120 µl dzeltens - - - - Tukšs ! Lietoto stobriņu pārskats:

  8. 1. Paraugu sagatavošana P1 – P8 • Uzrakstiet uz 8 dzeltenajiem stobriņiem savas darba • grupas Nr.! • Piepiliniet 60 µl primārā antivielu šķ. (p AV, pozitīvā • testa rezultātu) vai • 60 µl mazgājošā buferšķīduma ( MB, negatīvā testa • rezultātu) katrā no dzeltenajiem stobriņiem ar Nr. no • P1 līdz P8! Numurējiet tos! • Izsniedziet pa vienam stobriņam katrai darba grupai! !

  9. Stobriņa saturs Krāsa Apzīmējums Tilpums zaļš AG antigēns 800 µl oranžs sAB Sekundārās antivielas 800 µl brūns SUB substrāts 800 µl violets pAB Primārās antivielas 120 µl zils M B Buferšķīdums mazgāšanai 120 µl dzeltens P1-P8 Asins serumu paraugi ” no 1-8 60 µl katrā Sagatavoto stobriņu pārskats:

  10. 2. ELISA testa veikšana

  11. 2.1 Antigēnu saistīšana uz mikrotitrēšanas stobriņiem - Apzīmējiet stobriņus pēc sekojoša parauga! + + - - P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 • Iepiliniet 50 µl antigēnu šķ. (AG, zaļais stobriņš) – katrā no 12 stobriņiem! • Inkubējiet tos 5 min.!

  12. Antivielu pierādīšanapamatlikums • Antigēns piesaistās pie virsmas

  13. 2. Mikrotitrēšanas stobriņu mazgāšana • Izkratiet stobriņu saturu uz salvetēm! • Iepiliniet 250 µl mazgājošā bufera katrā no stobriņiem! Uzmanību!Pilinot buferšķīdumu trauciņu mazgāšanai, tas nedrīkst ielīt citos stobriņos! • Vēlreiz izkratiet stobriņu saturu uz salvetēm!

  14. Antivielu pierādīšanapamatlikums • Antigēni piesaistās pie virsmas • Visa virsma ir “ aizņemta” ar piesaistītajām antivielām

  15. + + - - P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 2.3. Paraugu sagatavošana kontrolei pAb • Pozitīvai kontrolei: piepiliniet 50 µl primāro antivielu • ( pAV, violetajā stobriņā) divos ar“ + ”apzīmētajos stobriņos! • Negatīvai kontrolei:piepiliniet 50 µl mazgājošo buferšķ. ( MB,zilajā stobriņā) divos ar “ - ” lapzīmētajos stobriņos! WB

  16. + + - - P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 2.3. Paraugu sagatavošana kontrolei • Paraugos 1-8:piepiliniet 50 µl testējamo personu serumus P1- P8 katrā no atbilstošajiem 8 stobriņiem! • Lietojiet jaunus uzgaļus katram stobriņam! • Inkubējiet tos 5 min.!

  17. Antivielu pierādīšanapamatlikums • antigēns piesaistās pie virsmas • visa virsma ir “aizņemta” ar piesaistītajām antivielām • pievienojot serumu, var pierādīt antivielu klātbūtni

  18. 2.4. Mikrotitrēšanas stobriņu mazgāšana(skatīt 2.2.) tukšs + 250 µl M B tukšs

  19. 2.5. Sekundāro antivielu pievienošana • Piepiliniet 50 µl sekundāro antivielu šķ. (sAB, oranžais stobriņš) katrā no12 stobriņiem! • Inkubējiet tos 5 min.!

  20. Antivielu pierādīšanapamatlikums • antigēns piesaistās pie virsmas • visa virsma ir “aizņemta” ar piesaistītajām antivielām • pievienojot serumu, var pierādīt antivielu klātbūtni • enzīma piesaistītās antivielas piesaistās pie antivielu epitopa

  21. 2.6. Mikrotitrēšanas stobriņu divkārša mazgāšana (skatīt 2.2. ) tukšs + 250 µl MB tukšs

  22. 2.7. Substrāta pievienošana • Piepiliniet 50 µlsubstrāta šķ.(SUB, brūnais stobriņš)katrā no 12 stobriņiem! • Inkubējiet tos 5 min.!

  23. Antivielu pierādīšanapamatlikums • antigēns piesaistās pie virsmas • visa virsma ir “aizņemta” ar piesaistītajām antivielām • pievienojot serumu, var pierādīt • antivielu klātbūtni • enzīma piesaistītās antivielas piesaistās pie antivielu epitopa • reakcija tiek pierādīta ar enzīmu iesaistīšanos reakcijās

  24. + + - - P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 3. Izvērtējums Tests ir + , ja stobriņu saturs kļūst zils. Tests ir - , ja to saturs paliek bezkrāsains ( kā kontrole). Salīdziniet savas darba grupas rezultātus ar citām!

More Related