Tecnología de ADN Recombinante

1. Tecnología de ADN Recombinante Prof. Javier Cabello Schomburg, MS

2. Reflexión • Cada criatura, al nacer, nos trae el mensaje de que Dios todavía no ha perdido la esperanza en los hombres. • Rabindranath Tagore

3. Árbol Filogenético de la Vida Dominio Bacteria: Bacterias en sentido estricto o eubacterias (todos unicelulares procariotas)Dominio Archaea: Arqueobacterias o arqueas. Son un linaje de procariotas unicelulares totalmente distintos a las eubacterias.Dominio Eukarya: Eucariotas (tanto unicelulares como pluricelulares).

4. ¿Qué es un organismo modelo? • Son una herramienta fundamental en algunas áreas de la investigación científica, ya que permiten realizar estudios sobre determinados caracteres y los resultados pueden ser extrapolados a otras especies • Las especies que se eligen como modelo tienen las siguientes características en común: • Fácil manutención y manipulación en el laboratorio;- Ciclos de vida cortos;- Gran número de descendencia;- Disponibilidad de variabilidad fenotípica y genotípica;- Fenotipo de interés sencillo de observar o medir;- Técnicas de estudio puestas a punto para estas especies.

5. organismos modelo en Genética

6. Tecnología del ADN El genoma de un organismo es el juego completo de ADN. La planificación del Proyecto Genoma Humano se inició en 1986, previsto para el 2007. En Junio de 2000 se presentó el 90% del borrador con la secuenciación de unos 30,000 genes y 3 mil millones de pares de bases (pb). Los genes son secuencias específicas de bases que codifican instrucciones para hacer proteínas. Los genes son un 2% del genoma humano. Entre una persona y otra el ADN solo difiere en 0.2% 60% IDENTIDAD GENÉTICA De 289 genes humanos implicados en enfermedades, hay 177 cercanamente similares a los genes de Drosophila. 20% 70% 95% idéntico Humanos 30,000 genes Chimpancé 30,000 genes Ratón 30,000 genes A. thaliana 25,000 genes C. elegans 19,000 genes D. melanogaster 13,000 genes

7. Enzimas de Restricción“Tijeras Moleculares”

8. ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION • En 1968 se purificó la primera endonucleasa de restricción, la K12 en E coli. • Cortaba fragmentos largos y concretos, por lo que se • pensó que reconocía secuencias específicas del ADN. • Se abandonó porque aunque reconocía una zona • determinada del ADN, cortaba al ADN a varias Kb de distancia. • En 1970 se aísla otra endonucleasa de restricción en • Haemophilus influenzae, que reconoce y una secuencia en un duplex de ADN y la rompe en ese lugar produciendo • fragmentos discretos de longitud y secuencia bien definidos.

9. ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION Fenómeno de restricción: reconocimiento por parte de una bacteria de un ADN extraño y lisis del mismo en pequeños fragmentos. El fenómeno de restricción se descubrió en E coli, cuando se hizo crecer el bacteriófago lambda. Si la bacteria crece encontraremos varias colonias por placa. Si no crece, no encontaremos colonias. En la cepa C de E coli crecía bien el bacteriófago , pero si este se crecía en la cepa K o la R, la eficiencia de crecimiento era mucho menor o nula. El fago era restringido por esta cepa.

10. MODIFICACION- RESTRICCION Típico ejemplo de restricción de crecimiento del bacteriófago lambda en una cepa determinada de E. coli La eficiencia con la que el fago crece en una cepa depende de la última cepa donde fue propagado.

11. MODIFICACION- RESTRICCION Explicación: El DNA del fago es degradado en cuanto se incorpora, y a la endonucleasa responsable de esta degradación se le llama endonucleasa de restricción o enzima de restricción. El huésped restrictivo debe proteger a su propio ADN de la acción de las enzimas de restricción y para ello modifica a su propio ADN. Modificación: metilación de ciertas bases en un número muy limitado, justo en los lugares de reconocimiento de las enzimas de restricción. El DNA del fago que sobrevive algún ciclo en el huésped restrictivo se replica y también es metilado por las metilasas de la bacteria, y por tanto modificado y protegido, y puede crecer bien en una nueva reinfección.

12. METILACION Y RESTRICCION

13. SISTEMAS DE RESTRICCION Y MODIFICACION

14. SISTEMAS DE RESTRICCION Y MODIFICACION Nomenclatura: Tres letras: 1a letra de género de la bacteria donde se encontró 2a y 3a letras especie de la bacteria donde se encontró Letra de la cepa donde se produce la enzima de restricción (si es alguna cepa especial) Si en la misma bacteria hay varios sistemas de restricción, se especifica por números romanos.

15. ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION Extremos cohesivos Extremos romos

16. ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION Para reconocer el tamaño de los fragmentos que se producen tras la acción de una endonucleasa de restricción se utiliza la electroforesis en gel de agarosa y la tinción con bromuro de etidio.

17. ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION Se han estudiado 10,000 bacterias para Encontrar enzimas de restricción. Se han encontrado 3,000 enzimas de Restricción específicas para aproximada mente 200 secuencias de ADN. Las enzimas diferentes que tienen especificidad por la misma secuencia de ADN y que cortan en el mismo sitio se les llama isoschizomeros. Si reconocen la misma secuencia pero cortan en diferente lugar al ADN se les denomina neoeschizomeros. www.rebase.neb.com

18. ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION El número y el tamaño de fragmentos de ADN generados por una enzima de restricción depende de la frecuencia de aparición De los lugares diana en el ADN. Teóricamente, si tenemos un ADN que sea: - 50% de frecuencia de C+G - las cuatro bases distribuidas al azar El número de cortes en sería cada: si la secuencia diana es de 4 bases corte cada 44(256) bases si la secuencia diana es de 6 bases corte cada 46 (4096) bases En la práctica, no ocurre exactamente así.

19. EcoRI ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN • Son nucleasas que reconocen las moléculas de ADN en sitios determinados, por medio del reconocimiento de secuencias específicas • Las secuencias de reconocimiento son palindrómicas • Tipos de endonucleasas de restricción: • tipoI y III: cortan el ADN en sitios poco específicos y distantes del sitio de reconocimiento • tipo II: cortan las dos hebras de DNA en puntos equivalentes, muy específicos, dentro de la secuencia de reconocimiento. Son las más útiles en ingeniería genética. • EcoRI: efectúa cortes escalonados en la secuencia palindrómica específica de 6pb • EcoRI: genera fragmentos complementarios de hebra simple denominados fragmentos de restricción con extremos cohesivos

20. Sitios de corte Eje de simetría doble ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN • Sitios de restricción: secuencias palindrómicas reconocidas por las endonucleasas de restricción. EcoRIgenera fragmentos de restricción con extremos cohesivos EcoRVgenera fragmentos de restricción con extremos romos

21. ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN • Nomenclatura: mediante tres letras tomadas del género y la especie de la bacteria de la que se aislaron originalmente, seguida de una letra que indica el serotipo y un nº romano, en el caso de haber encontrado diferentes enzimas en una misma variente • Se han caracterizado más de 3000 enzimas de restricción de tipo II con más de 200 secuencias de reconocimiento diferentes.

22. Sitios de restricción para EcoRI A B C D E F G MAPAS DE RESTRICCIÓN • Digestión de una molécula de DNA con una enzima de restricción. • Separación de los fragmentos de restricción mediante electroforesis

23. MAPAS DE RESTRICCIÓN • Construcción de un mapa de restricción • Perfil electroforético de los fragmento de restricción • Mapa de restricción del DNA, resultante de la información obtenida en (a)

24. MAPAS DE RESTRICCIÓN • Digestión del plásmido pAgK84 con: • BamHI(A) • PstI(B) • BglII (C) • HaeIII (D) • HincII (E) • SacI (F) • XbaI (G) • HpaI (H) • Carril I: fragmentos de DNA de tamaño conocido • Aplicación de los mapas de restricción: polimorfismos de longitud de los fragmentos de restricción (RFLP), valiosos para el diagnóstico de enfermedades hereditarias.

25. MAPAS DE RESTRICCIÓN • Aplicación de los mapas de restricción: polimorfismos de longitud de los fragmentos de restricción (RFLP), valiosos para el diagnóstico de enfermedades hereditarias.

26. Vectores de clonación • Los vectores de clonación son moléculas pequeñas de DNA que se replican de manera autónoma • Tipos de vectores • Plásmidos • moléculas de DNA circular que se encuentran en bacterias o levaduras • se pueden clonar fragmentos de DNA de no más de 10 kpb • Bacteriófagos • fagos que infectan bacterias • se pueden clonar fragmentos de DNA de hasta 16 kpb • Cromosomas artificiales bacterianos (BAC) y de levaduras (YAC) • se pueden clonar fragmentos de DNA de hasta varios cientos de kpb

27. Vectores de clonación • PLÁSMIDOS Componentes básicos de un vector de clonación plasmídico ori (origen de replicación) HindIII PstI SalI BamHI SmaI SacI EcoRI ampr (marcador de selección) Policonector (“polylinker”) Región donde se puede insertar el DNA extraño

28. Vectores de clonación • PLÁSMIDOS Estructura y componentes del plásmido pUC18 (plásmido de clonación universal) • Policonector: contiene 13 sitios de restricción únicos • 3 genes: permiten la selección de clones recombinantes ampR: resistencia a la ampicilina LacZ: b-galactosidasa lacI: regulador de la expresión de LacZ

29. No necesaria para la infección lítica Fago l infectivo con un fragmento extraño de DNA enzima de restricción y separación de los fragmentos Empaquetamiento in vitro Apareamiento y unión El DNA l remanente contiene los genes necesarios para la infección pero es pequeño para el empaquetamiento DNA recombinante Fragmento de DNA extraño de 15 kpb Vectores de clonación • BACTERIÓFAGO l

30. Transformación y selección Vector recombinante Cromosoma de E. Coli Transformación de bacterias • Las bacterias se crecen sobre placas que contienen agar y ampicilina (antibiótico). Replicación del plásmido • Sobreviven las células transformadas, por poseer el gen AmpR, el resto mueren. Multiplicación celular

31. Transformación y selección • Selección de clones que han incorporado un vector recombinante X-gal: análogo de la lactosa • Las células que incorporan un vector no recombinante (pUC18 no modificado) son azules

32. Biblioteca de ADN Biblioteca genómica colección de clones formados a partir de todos los fragmentos de ADN del genoma de una especie, tejido o tipo celular. Biblioteca de ADN genómico losfragmentos de ADN provienen de la escisión del genoma. Contiene regiones codificantes y no codificantes. Se genera por clonación de fragmentos genómicos al azar. Biblioteca de cADN los fragmentos provienen de los mARNs retrotranscritos. Contiene sólo las secuencias expresadas de un tipo particular de célula.

33. TÉCNICAS DEL ADN RECOMBINANTE

34. mARNs Construcción de Bibliotecas de cADN ADN

35. mRNAs Construcción de Bibliotecas de cADN Hibridación Cebador oligodT RT Retrotranscripción de mRNAs a cDNA Eliminación del RNA (con álcali) Adición de una cola de polidG oligodC Síntesis hebra complementaria Metilación DNA cDNA

36. Construcción de Bibliotecas de cADN cDNA Ligador EcoRI Región reemplazable EcoRI EcoRI Ligación Empaquetamiento “in vitro” Vector: bacteriófago Viriones l recombinantes Infección de E. Coli Clones l individuales

37. Cribado de la genoteca • Hibridación de colonias “in situ” • Las colonias se transfieren desde una placa de cultivo a un filtro de nitrocelulosa • Tratamiento del filtro con álcali y posterior secado; el DNA desnaturalizado queda unido al filtro • Apareamiento con una sonda marcada radiactivamente; formación de híbridos con su DNA complementario • Autorradiografía 1 3 2 4 Colonias detectadas por la sonda

38. SOUTHERN BLOT • Permite identificar un fragmento de DNA individual mediante hidridación con una sonda marcada DNA Escisión con enzimas de restricción membrana autorradiografía gel Papel de filtro membrana gel electroforesis Disolución alcalina Transferencia del DNA, por capilaridad, del gel a la membrana; el medio alcalino desnaturaliza el DNA. hidridación con la sonda marcada revelado

39. NORTHERN 48 h 96 h NT • Permite analizar la expresión de un mRNA determinado • Etapas: • Aislamiento del RNA • Separación mediante electroforesis • Transferencia del RNA a una membrana de nitrocelulosa • Hibridación con una sonda marcada, complementaria al gen buscado • Autorradiografía Ej.: Expresión del mRNA de b-globina en células diferenciadas de eritroleucemia NT: células no diferenciadas 48h: células diferencias durante 48h 96h: células diferencias durante 96h La intensidad de la banda es proporcional a la cantidad de mRNA expresada

40. PCR • PCR: reacción en cadena de la polimerasa (polymerase chain reaction) • Permite amplificar regiones de DNA de secuencias conocidas cebador cebador • Etapas: • Desnaturalización del DNA: 95ºC • Hibridación con un exceso de cebadores: 50- 60ºC • Cebador: oligonucleótido de 18-20 nt de longitud • Tienen secuencia complementaria a los extremos 3’ del segmento de DNA de interés • Síntesis de DNA: 72 ºC • Taq polimerasa (Thermus aquaticus, bacteria de aguas termales) • Estas etapas se repiten entre 20 a 30 veces

41. Desnaturalización Hidridación Ciclo 3 Desnaturalización Hidridación Ciclo 1 Síntesis Desnaturalización Hidridación Ciclo 2 Síntesis Síntesis Ciclos 4, 5, 6, etc… PCR La secuencia deseada (delimitada por los cebadores) se incrementa exponencialmente, alrededor de un millón de veces después de 20 ciclos; el resto de secuencias en la muestra de DNA original permanece sin amplificar.

42. CLONACIÓN • CLONACIÓN: obtención de un clon

43. Apareamiento de fragmentos de DNA extraño con el vector de clonación y ligamiento DNA extraño Vector de clonación Endonucleasa de restricción DNA recombinante TÉCNICAS DE CLONACIÓN CLONACIÓN de vectores recombinantes • Se genera un fragmento de DNA de tamaño adecuado (con una enzima de restricción, por PCR o por síntesis química) • El fragmento se incorpora dentro de otra molécula de DNA conocida como vector, que tiene las secuencias necesarias para dirigir la replicación del DNA • El vector, con el DNA de interés, denominado DNA quimérico o recombinante, se introduce en células huésped donde se replica. Transformación • Las células que contienen el DNA buscado se identifican. Selección

44. TÉCNICAS DE CLONACIÓN • Ligación: unión de fragmentos de restricción por una DNA ligasa DNA vector DNA genómico fragmentos de restricción no apareados (b) y (c) 2 ATP DNA ligasa T4 2 AMP + 2 PPi DNA recombinante