Zytogenetik der Non-Hodgkin-Lymphome des Kindes- und Jugendalters

1. Zytogenetikder Non-Hodgkin-Lymphome des Kindes- und Jugendalters Jochen Harbott, Onkogenetisches Labor, Abt. Pädiat. Hämatol./Onkol., Gießen

2. Chromosomale Aberrationen bei ALL pro-B common prä-B B-ALL T-ALL AUL mixed Jochen Harbott, Onkogenetisches Labor, Abt. Pädiat. Hämatol./Onkol., Gießen

3. Chromosomale Aberrationenbei B-NHL/B-ALL t(2;8)(p11;q24) t(8;22)(q24;q11) t(8;14)(q24;q32) c-MYC IgH, Ig, Ig Jochen Harbott, Onkogenetisches Labor, Abt. Pädiat. Hämatol./Onkol., Gießen

4. 5 2 Bruchpunkte der Partnerchromosomen bei varianten 2p23-Translokationen Chromosomale Aberrationenbei ALCL t(2;5)(p23;q35) Jochen Harbott, Onkogenetisches Labor, Abt. Pädiat. Hämatol./Onkol., Gießen

5. t(1;14)(p32;q11) Partnergene TAL1  1p32 HOX11  10q24 RHOM2  11p13 TCL1  14q32 MYC 8q24 LMO1  11p15 t(10;14)(q24;q11) t(11;14)(p13;q11) inv(14)(q11q32) Aberrationen in T-Zell-Lymphomen 14q11  TCRa Weitere Translokationen t(8;14)(q24;q11) t(11;14)(p15;q11) Jochen Harbott, Onkogenetisches Labor, Abt. Pädiat. Hämatol./Onkol., Gießen

6. Aberrationen in T-Zell-Lymphomen 7q35  TCRß Aberration Partnergen t(1;7)(p34;q35) LCK t(7;10)(q35;q24) HOX11 t(7;19)(q35;p13) LYL1 Jochen Harbott, Onkogenetisches Labor, Abt. Pädiat. Hämatol./Onkol., Gießen

7. Genetische Diagnostik • klassische Zytogenetik • G-, R-, Q-, C-Bandenfärbung • Molekulare Zytogenetik Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) • Chromosomen-Painting (WCP) • Zentromer-Sonden • YAC and Cosmid-Sonden • 24-Farben-FISH (SKY/M-FISH) Comparative genomic hybridization (CGH) • CGH auf Chromosomen • Array CGH • Molekulargenetik • Long distance (LD-) PCR • reverse transcriptase (RT-) PCR • real time quantitative (RQ-) RT-PCR Jochen Harbott, Onkogenetisches Labor, Abt. Pädiat. Hämatol./Onkol., Gießen

8. Zytogenetik • Versand • Zellgewinnung • 24 Std.-Kultur • Zugabe von Colchizin • Herstellung der Präparate • Hypotone Phase • Fixieren in Alkohol:Eisessig 3:1 • Auftropfen • Färbung • G-Banden-Färbung • Auswertung • Computergesteuerte Bildverarbeitung Voraussetzung: genügend vitale Zellen Jochen Harbott, Onkogenetisches Labor, Abt. Pädiat. Hämatol./Onkol., Gießen

9. MYC-Translokation MYC normal Nachweis von 8q24-Aberrationen mit break-apart-Sonde Jochen Harbott, Onkogenetisches Labor, Abt. Pädiat. Hämatol./Onkol., Gießen

10. 24-Farben-FISH 43~45,X,-Y,der(1)t(1;5)(q10;?p10),+der(1)t(1;5)(q10;?p10),del(6)(q15),der(8)t(8;13)(p?; q?)t(8;22)(q24;q11),-10,-15,del(16)(q13),der(22)t(8;22)(q24;q11),+mar,inc[cp4]/43~45, idem,-der(22)t(8;22)(q24;q11),+mar,inc[cp3]/46,XY[2] Jochen Harbott, Onkogenetisches Labor, Abt. Pädiat. Hämatol./Onkol., Gießen

11. DNA-Verlust zB Monosomie, Deletion Referenz-DNA Tumor-DNA DNA-Zugewinn zB Trisomie, Duplikation Comparative Genomic Hybridization (CGH) Nachweis der Aberration durch Fluoreszenz-Markierung normaler Chromosomen Jochen Harbott, Onkogenetisches Labor, Abt. Pädiat. Hämatol./Onkol., Gießen

12. Polymerase KettenreaktionPolymerase Chain Reaction (PCR) 94°C 72°C 60°C Jochen Harbott, Onkogenetisches Labor, Abt. Pädiat. Hämatol./Onkol., Gießen

13. Alternative Methoden zum Nachweis Lymphom-spezifischer Aberrationen • Interphase-FISH am Ausstrich/Tupfpräparat oder nach Kultur mit break-apart-Sonde • Nachweis einer MYC- oder ALK-Translokation • Metaphase-FISH nach Kultur mit break-apart-Sonde • Nachweis einer MYC- oder ALK-Translokation (und des Partner-chromosoms) • 24-Farben-FISH nach Kultur • Nachweis der 8q- oder 2p-Translokation und des Partner-chromosoms • zusätzlich weitere Aberrationen (außer inv, kleinen del oder ins) • Comparative genomic hybridization (CGH) • Nachweis eines Zugewinns oder Verlustes von Chromosomen-stücken oder einzelnen Genen • Polymerase-Kettenreaktion (LD-PCR, RT-PCR) • Nachweis des MYC- oder ALK-Rearrangements und des Fusions-partners Jochen Harbott, Onkogenetisches Labor, Abt. Pädiat. Hämatol./Onkol., Gießen

14. Probleme bei der zytogenetischen Auswertung von Lymphomen oft normaler Karyotyp oder kein Ergebnis • mögliche Ursachen: • keine Proben eingesandt • inadäquate Versandbedingungen • nicht genügend Lymphomzellen • Knochenmark ohne Befall • kein Tumormaterial eingesandt • eingesandtes Material kein Tumor (V.a. Lymphom) • Lymphomzellen gehen schnell in Apoptose • inadäquate Kulturbedingungen (Medium/Zeit) • kryptische Aberrationen Jochen Harbott, Onkogenetisches Labor, Abt. Pädiat. Hämatol./Onkol., Gießen

15. Häufigkeit unterschiedlicher Karyotypen bei B-NHL 963 Patienten aus mehreren BFM-NHL Studien 199 vollständige Karyotypen Jochen Harbott, Onkogenetisches Labor, Abt. Pädiat. Hämatol./Onkol., Gießen

16. Warum Zytogenetik? • spezifische Aberrationen kann man auch mit anderen Methoden nachweisen • Herstellung von Metaphasepräparaten schwierig (Kultur etc.) • Ergebnis fraglich (z.B. normaler Karyotyp) Jochen Harbott, Onkogenetisches Labor, Abt. Pädiat. Hämatol./Onkol., Gießen

17. Häufigkeit von Sekundäraberrationen Jochen Harbott, Onkogenetisches Labor, Abt. Pädiat. Hämatol./Onkol., Gießen

18. aberration abs % aberration abs % 1q+ 20 43.5 1q+ 1 6.2 der(3q) 3 6.5 der(3q) 1 6.2 6q- 5 10.9 6q- 5 31.3 +7/7q+ 7 15.2 +7/7q+ 1 6.2 9p- 3 6.5 9p- 0 0 11q23 4 8.7 11q23 5 31.3 +12/12q+ 2 4.3 +12/12q+ 2 12.5 13q- 8 17.4 13q- 1 6.2 del(17p) 2 4.3 del(17p) 0 0 complex 18 39.1 complex 4 24.8 others 23 50.0 others 13 75.0 Häufigkeit sekundärer Aberrationen bei Burkitt-NHL sekundäre Aberrationen mit 8q24 Aberrationen ohne 8q24 Jochen Harbott, Onkogenetisches Labor, Abt. Pädiat. Hämatol./Onkol., Gießen

19. Häufigkeit von 2p23-Aberrationen bei ALCL Jochen Harbott, Onkogenetisches Labor, Abt. Pädiat. Hämatol./Onkol., Gießen

20. Sekundäraberrationen bei NHL im Kindesalter • prognostische Bedeutung noch unklar • möglicherweise schlechtere Prognose für einige Aberrationen • Bedeutung für Lymphomentstehung Jochen Harbott, Onkogenetisches Labor, Abt. Pädiat. Hämatol./Onkol., Gießen

21. Problemlösung für ein gutes Ergebnis • ausreichend Material verschicken • gutes Material • möglichst Tumorgewebe • Gewebe nicht austrocknen lassen • vitale Zellen • adäquate Versandbedingungen • möglichst sofort versenden • innerhalb von 24 Std. im Labor • Kurierdienst (Ankunft bis 10.00 Uhr) Jochen Harbott, Onkogenetisches Labor, Abt. Pädiat. Hämatol./Onkol., Gießen

22. NHL-BFM-Materialversand KM-Befall und/oder Pleuraerguss und/oder Aszites nur Tumor Punktion Biopsie Diagnosestellung NHLimmunologisch und zytomorphologisch Diagnosestellung NHLhistologisch und immunhistochemisch • flüssiges Material heparinisiert • Zytospinpräparate bzw. Ausstriche • flüssiges Material heparinisiert • Zytospinpräparate bzw. Ausstriche • Liquor, KM, Blut, Serum • Tumormaterial in Medium • Tumortupfpräparate • Liquor, KM, Blut, Serum • Tumormaterial formalinfixiert Immunologie Immunologisches Zellmarkerlabor, Berlin Zytomorphologie / Genetik / Zellbank Onkogenetisches Labor und NHL-BFM-Studienzentrale Gießen Histologie / Immunhistochemie LK-Register, Kiel oder ein anderes referenzpathologisches Institut der NHL-BFM-Studie Jochen Harbott, Onkogenetisches Labor, Abt. Pädiat. Hämatol./Onkol., Gießen