1 / 14

Rakubioloogia praktikum II osa

Rakuorganellide märkimine immuunofluorestsentsi meetodil. HeLa kasvajarakkudes olevate lüsosoomide, aktiini fiibrite ja tuuma visualiseerimine. Rakubioloogia praktikum II osa. Töö etapid. Rakkude fikseerimine Rakkude permeabiliseerimine Blokeerimine Töötlus primaarse antikehaga

iolani
Download Presentation

Rakubioloogia praktikum II osa

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript


  1. Rakuorganellide märkimine immuunofluorestsentsi meetodil.HeLa kasvajarakkudes olevate lüsosoomide, aktiini fiibrite ja tuuma visualiseerimine Rakubioloogia praktikum II osa

  2. Töö etapid • Rakkude fikseerimine • Rakkude permeabiliseerimine • Blokeerimine • Töötlus primaarse antikehaga • Töötlus sekundaarse antikehaga ja aktiini fiibritega seonduva värviga • Rakutuumaga seonduva värviga inkubeerimine • Alusklaasile sulundamine

  3. HeLa rakud – pärit emakakaela kasvajast, kultuuri viidud 60-ndatel aastatel. Doonoriks naine nimega Henrietta Lacks

  4. Rakkude fikseerimine ja permeabiliseerimine I • Fikseerimine – 30 min 4%-lise paraformaldehüüdiga fosfaat-puhverdatud soolalahuses (PBS) – rakus olevad valgud ristseotakse aminohappejäägi lüsiini kaudu

  5. Rakkude fikseerimine ja permeabiliseerimine II • Permeabiliseerimine • 2-3 minutit 0,1%-lise Triton X lahusega (lahustiks jälle PBS) – teeb rakumembraani lipiidse kihi auklikuks (detergent!) ja antikehadele ning muudele ühenditele läbipääsetavaks Triton-X 100 molekul

  6. Rakkude blokeerimine • Blokeerimine toimub valgulahusega (nt rasvavaba piimapulbri lahus või veise seerumalbumiini lahus). • 15 minutit 10%-lise piimapulbri lahusega PBS-s • Blokeerimislahuse valgud • vähendavad mittespetsiifilist signaali, blokeerides rakkudes kohad, kuhu antikeha võiks mittespetsiifiliselt seonduda (blokeerib ühendite passiivse adsorptsiooni) • stabiliseerivad pindadele seondunud biomolekule.

  7. Töötlus antikehadega I sekundaarne antikeha primaarneantikeha primaarneantikeha Otsene märkimine Kaudne märkimine Seda kasutame meie

  8. Töötlus antikehadega II • Primaarne antikeha – lüsosomaalse valguga LAMP-2 (lysosome-associated membrane protein 2) seonduv hiires tehtud monoklonaalne antikeha, lahjendus 1:100 (lahjendus teha 3%-lises lõssipulbrilahuses). • Lüsosoomid – madalama pHga (4,8) vesiikulid rakus, mille ülesandeks biomolekulide lagundamine (nukleaasid, proteaasid, fosfataasid jne) • Klaasi rakkudega inkubeerida 30 min ümberpööratult 30 µl-s tilgas, mis asetatakse vaharibale. • Pärast inkubeerimist klaas rakkudega tagasi kannu (rakkudega külg ülespoole!) ja 3x5 min pesu PBS-s.

  9. Töötlus antikehadega III • Sekundaarne antikeha – hiirest pärinevate valkudega seonduv antikeha, mille küljes fluorokroom Alexa Fluor 488 (roheline) • Samasse lahusesse lisatud ka aktiini fiibritega seonduv seenest pärit metaboliit falloidiin, märgitud fluorestseeruva ühendiga Alexa Fluor 594 (punane)

  10. Töötlus antikehadega IV • Inkubeerida rakkudega klaasi sekundaarset antikeha ja falloidiini sisaldava 3% lõssipulbrilahusega 15 minutit ümberpööratult 30 µl-s tilgas, mis asetatakse vaharibale. • Pärast inkubeerimist klaas rakkudega tagasi kannu (rakkudega külg ülespoole!) ja 4x5 min pesu PBS-s. • 3. pesu teha PBS-ga, kuhu lisatud tuumaga seonduv värv Hoescht (lahjendus 1:1000) • Pärast pesu Hoescht-ga teha veel üks pesu PBS-ga

  11. Klaaside sulundamine alusklaasile I • Sulundusvedelik peab säilitama fluorestseeruva ühendi fluorestsentsi ergastava valguse mõjul võimalikult hästi • Erinevaid sulundajaid palju, tihti tuleb eri fluorokroomide puhul kasutada kindlaid sulundajaid, et vältida pleekumist.

  12. Klaaside sulundamine alusklaasile II • Alusklaasile panna 10 µl sulundusvedelikku (30% glütserooli PBS-s) • Klaas tõsta kannust välja ja nõrutada vastu paberkäterätti liigsest PBS-st. Mitte segi ajada klaasi külgi! • Klaas lasta ettevaatlikult sulundusvedeliku sisse. • Üleliigne sulundusvedelik eemaldada paberkäterätiga väga kergelt alusklaasile vajutades • Küünelakk panna katteklaasi (ümmargune) servadele, mitte peale. See ei lase vedelikul ära aurata ja preparaat püsib paigal.

  13. Fluorestsentsi põhimõte

  14. Hoescht 33258 neeldumis- ja emissioonispekter Alexa Fluor 488 ergastus- ja emissioonispekter Alexa Fluor 594 ergastus- ja emissioonispekter

More Related