سمينار بحران آب نمونه برداري و آزمون هاي باكتريولوژي آب آشاميدني

1. سمينار بحران آبنمونه برداري و آزمون هاي باكتريولوژي آب آشاميدني رحيم دواني – مسؤول آزمايشگاه آب و فاضلاب آزمايشگاه آب و فاضلاب مركز بهداشت شهرستان شيراز سال 1386

2. نمونه برداری و آزمونهای باکتريولوژی آب

3. آئين كار نمونه‏برداري از آب جهت آزمون‏هاي باكتريولوژيكي 1 ـ هدف هدف از تدوين اين آئين كار ارائه يك راهنما براي روش و تواتر نمونه‏برداري از انواع مختلف آب جهت آزمون‏هاي باكتريولوژيكي مي‏باشد. 2 ـ دامنه كاربرد اين آئين كار در مورد آب آشاميدني , آب مصرفي صنايع غذائي و آب شناگاهها كاربرد دارد.

4. 3 ـ نكات عمومي 3 ـ 1 ـ هدف از نمونه‏گيري بدست آوردن قسمت كوچكي از آب است كه نمايانگر خصوصيات واقعي منبع اصلي باشد و عوامل مهم آن عبارتند از : نقاط نمونه‏گيري , زمان و تناوب نمونه‏گيري حفظ تركيبات نمونه تا لحظه آزمون 3 ـ 2 ـ در هر روش نمونه‏گيري قواعد زير بايد بكار رود . الف ـ نمونه‏ها بايد نمايانگر وضعيت موجود در نقطه نمونه‏گيري باشد . ب ـ حجم نمونه بايد در حدي باشد كه تكرار آزمون به تعداد مورد نظر ميسر گردد . ج ـ نمونه‏ها بايد طبق روشي جمع‏آوري بسته‏بندي و حمل و نقل شود كه پيش‏بيني و مراقبت‏هاي لازم جهت عدم تغيير در تركيبات و خصوصيات ويژه آن تا مرحله اجراي آزمايش صورت پذيرد . 3 ـ 3 ـ نمونه‏ها را بايد بطور معمول بدون جداكردن ذرات معلق برداشت و درصورتيكه آب موجود در منبع اصلي داراي مواد كلوئيدي و يا مواد معلق بهم پيوسته باشد . بايد نمونه‏ها بطور نسبي نمايانگر اين مواد نيز باشد .

5. 3 ـ ظروف مورد استفاده 3 ـ 1 ـ جنس ظروف - ظروف مورد مصرف در نمونه‏برداري آب بايد نسبت به دماي ستروني مقاوم بوده و در اين دما نبايد موادي از خود آزاد كنند كه براي رشد باكتري‏ها بازدارنده باشد و يا سبب افزايش رشد شود . براي اين منظور مي‏توان از بطري‏هاي شيشه‏اي (پيركس) و يا پلي‏كربنات‏هاي مقاوم به حرارت (پلي پروپيلين) و يا ظروف پلاستيكي سترون استفاده نمود . ظروف بايد از نوع دهان‏گشاد بوده 3 ـ 2 ـ آماده‏سازي ظروف 3 ـ 2 ـ 1 ـ شستشوي ظروف

6. 3 ـ 2 ـ 1 ـ 1 ـ ظروف شيشه‏اي نو الف ـ پس از شستشوي ظروف با محلول شوينده مناسب , با آب معمولي و بهداشتي آب‏كشي كنيد . ب ـ ظروف با را محلول اسيد هيدروكلريك (0/1 مول در ليتر) پر كنيد و اجازه دهيد مدت 16 ساعت بماند. پ ـ پس از بيرون ريختن اسيد آن را چندين مرتبه با آب معمولي و بهداشتي , آب‏كشي كنيد . ت ـ ظروف را از آب مقطر پر نموده و چند قطره شناساگر فنل‏فتالئين به آن اضافه كنيد, سپس در دماي 121 درجه سلسيوس به مدت 15 دقيقه اتوكلاو نمائيد . ث ـ در صورتي كه پس از توكلاو رنگ صورتي ظاهر شد, مراحل ب تا ت را تكرار كنيد.

7. ج ـ در صورتي كه رنگ صورتي ظاهر نشد . ظروف را حداقل شش بار با آب معمولي و بهداشتي نهايتا يكبار با آب مقطر آب‏كشي كنيد . 3 ـ 2 ـ 1 ـ 2 ـ ظروف شيشه‏اي مستعمل 6ـ ظروف را با آب و مواد شوينده مناسب شسته و حداقل شش بار با آب معمولي و نهايتا يكبار با آب مقطر آبكشي كنيد .

8. 3 ـ 2 ـ 2 ـ سترون نمودن ظروف ـ ظروف را مي‏توان به يكي از دو روش زير سترون نمود : 3 ـ 2 ـ 2 ـ 1 ـ اتوكلاو ـ ظروف بايد در دماي 121 درجه سلسيوس به مدت بيست 20 دقيقه تحت فشار 245 كيلو پاسكال سترون شوند . 3 ـ 2 ـ 2 ـ 2 ـ فور ـ ظروف را بايد در دماي 160±2 درجه سلسيوس به مدت حداقل 1/5 ساعت و يا در دماي 170±2 درجه سلسيوس به مدت حداقل يك ساعت سترون نمود .

9. 3 ـ 2 ـ 3 ـ خنثي كردن تركيبات گندزدا در مواردي كه آب مورد آزمون احتمالا حاوي كلر , دبرم، دي‏اكسيد كلر و يا ازون مي‏باشد , به منظور خنثي كردن اثر بازدارندگي اين مواد , لازم است كه نمونه‏برداري در ظروفي انجام شود كه پيش از سترون شدن به ظروف محلول تيوسولفات سديم (Na2S2O3) اضافه شده باشد . در مورد آب آشاميدني بايد به ازاي هر 125 ميلي‏ليتر گنجايش ظرف , يكدهم ميلي‏ليتر از محلول 3 درصد تيوسولفات سديم پيش از سترون شدن ظروف به آن اضافه نمود. (اين مقدار ميزان باقيمانده كلر 5 ميلي‏گرم در ليتر را خنثي مي‏كند). در مواردي كه ميزان باقيمانده كلر بيشتر است , به ازاي هر 125 ميلي‏ليتر گنجايش ظرف , بايد يك دهم ميلي‏ليتر از محلول ده درصد تيوسولفات سديم به ظروف تميز , پيش از سترون شدن اضافه نمود . (اين مقدار ميزان باقيمانده كلر 15 ميلي‏گرم در ليتر را خنثي مي‏كند).

10. در مورد ظروف يكبار مصرف , تيوسولفات سديم را در اتوكلاو سترون نموده و سپس تحت شرايط ستروني در مقادير ذكر شده به ظروف اضافه نمائيد . 3 ـ 2 ـ 4 ـ خنثي كردن باقيمانده فلزات سنگين ـ در مواردي كه آب حاوي فلزات سنگين با غلظت بيش از 0/01 ميلي‏گرم در ليتر است (خصوصا مس و روي) لازم است به منظور برطرف نمودن آن , نمونه‏برداري در ظروفي انجام شود كه پيش از سترون شدن حاوي سه دهم ميلي‏ليتر از محلول 15 درصد اتيلن دي‏امين‏تترااستيك اسيد (A.T.D.E)7 به ازاي هر 500 ميلي‏ليتر گنجايش ظرف باشد .

11. 4 ـ رعايت اصول كلي در نمونه‏برداري 4 ـ 1 ـ به منظور پيش‏گيري از آلودگي ثانوي , نمونه‏برداري بايد تحت شرايط ستروني انجام پذيرد . 4 ـ 2 ـ توصيه مي‏شود هنگام نمونه‏برداري از دستكش لاستيكي يكبار مصرف سترون استفاده نمود . 4 ـ 3 ـ در كليه موارد بايد از لبريز نمودن ظروف از آب خودداري نمود و حداكثر 2/3 ظرفيت ظرف پر شود (و يا 2/5 سانتيمتر از فضاي بالاي بطري خالي گذاشته شود). 4 ـ 4 ـ در صورتي كه از آب گندزدايي شده نمونه‏برداري مي‏شود , مقدار باقيمانده ماده گندزدا و همچنين PH در حين نمونه‏برداري بايد مشخص شود .

12. 4 ـ 5 ـ به طور معمول حجم 300 ميلي‏ليتر جهت انجام آزمون‏هاي ميكربي كافيست . 4 ـ 6 ـ آب نمونه‏برداري شده بايد تا رسيدن به آزمايشگاه و پس از آن تا زمان آزمايش در يخچال و يا در ظروف حاوي يخ در دماي 2 تا 5 درجه سلسيوس به دور از نور نگه‏داري شوند . توصيه مي‏شود نمونه‏ها , حداكثر 6 ساعت پس از نمونه‏برداري مورد آزمون قرار گيرند . 4 ـ 7 ـ حداكثر زمان بين نمونه‏برداري و آزمون 24 ساعت مي‏باشد . 4 ـ 8 ـ در مواردي كه امكان سرد كردن نمونه‏ها نيست , نمونه‏ها بايد حداكثر 2 ساعت پس از نمونه‏برداري آزمايش شوند در غير اين صورت نبايد آزمون انجام شود . 4 ـ 9 ـ به منظور تفسير صحيح اطلاعات بدست آمده از نتايج آزمون , لازم است جزئيات نمونه‏برداري به صورت اطلاعات زير بر روي ظروف به طريق خوانا و پايدار نوشته شود : تاريخ نمونه‏برداري (روز) زمان نمونه‏برداري (ساعت) موقعيت و منبع نمونه‏برداري , شرايط آب و هوا در زمان نمونه‏برداري (درجه حرارت محيط) فرآيندهاي انجام شده روي آب و نوع كاربرد آب .

13. 5 ـ روش نمونه‏برداري 5 ـ 1 ـ آب آشاميدني در صورتي كه نمونه از سيستم توزيع برداشته مي‏شود و شيرهاي نمونه‏برداري متعدد است , بهتر است شيري جهت نمونه‏برداري انتخاب شود كه به لوله اصلي نزديك‏تر است. همچنين از نقاط كور شبكه نيز بايد نمونه‏برداري انجام گيرد . ابتدا قسمت‏هاي خارجي سر شير (مانند صافي‏ها , افشانك‏ها8 و لوله‏هاي لاستيكي) را برداشته و اجازه دهيد آب به مدت 2 تا 3 دقيقه خارج شود . سپس جريان آب را كم كنيد و قسمت سر شير را با استفاده از محلول هيپوكلريت سديم 100 ميلي‏گرم در ليتر (Naocl) يا الكل اتيليك 70 درصد گندزدائي نموده سپس براي مدت 2 تا 3 دقيقه ديگر اجازه دهيد آب خارج شود و پس از آن نمونه‏برداري كنيد . در صورتي كه نمونه‏برداري از شيرهاي مخلوط انجام مي‏شود , پس از گندزدائي خروجي شيرها , ابتدا شير آب گرم را مدت 2 دقيقه و پس از آن شير آب سرد را مدت 2 تا 3 دقيقه باز بگذاريد و سپس نمونه را جمع‏آوري كنيد و در بطري را بلافاصله ببنديد .

14. 5 ـ 2 ـ آب چاه در صورتي كه نمونه از چاه با استفاده از پمپ مكانيكي يا دستي گرفته مي‏شود , ابتدا به مدت 5 دقيقه آب پمپ شده را بيرون بريزيد , و پس از گندزدائي خروجي پمپ مجددا مقدار ديگري آب بيرون ريخته شود , سپس مستقيمأ درون بطري نمونه‏برداري كنيد . 5 ـ 3 ـ آب سطحي ـ بطري را نزديك محل نمونه‏بردار نگه داريد و پس از برداشت آن در حالي كه در بطري در يك دست قرار دارد با دست ديگر گردن بطري را تا عمق 30 سانتيمتر در زير سطح آب فرو بريد به گونه‏اي كه سر بطري به طرف جريان آب قرار داشته باشد .

15. 5 ـ 4 ـ مخازن آب ـ نمونه بايد از شيرهاي نمونه‏برداري تعبيه شده در بدنه مخزن جمع‏آوري شود . در مواردي كه مخزن فاقد شير است با فرو بردن گردن بطري در داخل آب تا عمق حدود 30 ـ 15 سانتيمتر نمونه‏برداري شود از برداشت نمونه از قسمت‏هاي سطحي و يا رسوب ته مخزن بايد خودداري نمود . 5 ـ 5 ـ آب استخر در مورد استخرهائي كه داراي صافي هستند نمونه بايد از طريق شيرهاي نمونه‏برداري تعبيه شده در خط برگشتي لوله تخليه صافي برداشته شود . در صورتي كه شير نمونه‏برداري موجود نيست , در عمق يك متري , بطري نمونه‏برداري را با زاويه 45 درجه درون آب تا عمق 20 سانتيمتر فرو بريد و نمونه‏برداري كنيد . از آنجا كه بيشتر ميكروارگانيسم هائي كه از طريق ترشحات بدن وارد آب شده در لايه‏هاي نزديك به سطح قرار مي‏گيرد , لازم است يك نمونه اضافي ديگر از بالاترين لايه سطحي آب9 برداشته شود . براي اين منظور پليت شيشه‏اي سترون 20*20 سانتيمتر را به طور عمودي در سطح آب فرو بريد , سپس با حركت دادن آن در فاصله 6 سانتيمتر مربع آن را از آب بيرون بياوريد

16. 6 ـ تواتر و زمان نمونه‏برداري تواتر نمونه‏برداري و آزمون بسته به نوع و منبع آب , جمعيت تحت پوشش , اندازه و حجم آب مصرفي , فصل سال , نوع تصفيه و بالاخره احتمال آلودگي و بروز بيماري‏هاي واگير متفاوت مي‏باشد . براي مثال در مورد آب آشاميدني تأمين شده از منابع آب زيرزميني10 توصيه مي‏شود و هر دو هفته يكبار و براي منبع آب سطحي 11 هر هفته يكبار نمونه‏برداري انجام شود . در مورد آب استخر نمونه‏برداري بايد در ساعاتي انجام شود كه حداكثر تعداد افراد شناگر از آن استفاده مي‏كنند و تواتر نمونه‏برداري هر دو هفته يكبار مي‏باشد .

17. تواتر نمونه‏برداري بايد در موارد شيوع بيماري , افت شديد فشار آب در شبكه , حوادث غير مترقبه ماننده (سيل , زلزله و ...) و ساير موارد اضطراري و همچنين در موارد قطع موقتي آب و تعميرات افزايش يابد . ـ در مورد آب‏هاي لوله‏كشي نشده و تصفيه نشده به علت اينكه احتمال آلودگي تابع شرايط منطقه‏اي و تغييرات فصلي مي‏باشد , علاوه بر كنترل ماهيانه در صورت پيدايش هرگونه تغيير نيز بايد نمونه‏برداري انجام گيرد . ـ در مورد آب آشاميدني در سيستم توزيع حداقل تواتر نمونه‏برداري بصورت جدول زير مي‏باشد . همان‏طور كه در جدول مشخص است , تكرار نمونه‏برداري به ازاي افزايش جمعيت افزايش مي‏يابد . (به علت اينكه تعداد افراد بيشتري در معرض خطر هستند) و افزايش تواتر نمونه‏برداري كنترل صحيح كيفيت آب را امكان‏پذير مي‏سازد

18. حداقل تواتر نمونه برداري براي آب آشاميدني در سيستم توزيع مثال 1 ـ از شبكه توزيع منبع آبي كه مورد استفاده هشتاد هزار نفر قرار مي‏گيرد , هر ماه حداقل شانزده نمونه بايد مورد آزمايش قرار گيرد . مثال 2 ـ از شبكه توزيع منبع آبي كه مورد استفاده پنج ميليون نفر قرار مي‏گيرد , هر ماه پانصدوده نمونه بايد مورد آزمايش قرار گيرد .

20. آيين‌كار آزمون‌هاي باكتريولوژيكي آب 1- هدف هدف از تدوين اين آئين‏كار , ارائه يك راهنما 1 جهت انجام آزمون‏هاي باكتريولوژيكي آب مي‏باشد اين آئين كار شامل آماده سازي نمونه و روش‏هاي مختلف شمارش انواع ميكروارگانيسم‏هاست . 2- دامنه كاربرد اين آئين‏كار در مورد آب آشاميدني , آب معدني بطري شده , آب استخر و شناگاههاي طبيعي كاربرد دارد .

21. 3- مواد اوليه به منظور بدست آوردن نتايج هماهنگ , لازم است از مواد اوليه‏اي با كيفيت و درجه خلوص يكسان , استفاده نمود آب مورد مصرف نيز بايد از نوع تقطير شده با تجهيزات شيشه‏اي 2 بوده و عاري از مواد بازدارنده از رشد ميكروارگانيسم‏ها باشد . در صورتي كه آب مقطر از آب كلرينه شده تهيه مي‏شود بايد قبل از تقطير ; كلر آن خنثي شود . 3-2- محيط كشت - براي آماده كردن محيطهاي كشت دستورالعمل سازنده بايد به طور دقيق رعايت شود . بسياري از محيطهاي كشت را مي‏توان پس از سترون شدن به صورت كاملا دربسته در دماي 22-18 درجه سلسيوس به مدت حداكثر 3 ماه نگه داري نمود . محيطهائي كه تحت شرايط ستروني تقسيم و توزيع مي‏شوند را مي‏توان در دماي 10-4 درجه سلسيوس حداكثر به مدت يك ماه نگه‏داري نمود . كليه محيطهاي كشت بايد قبل از مصرف از نظر آلودگي , تبخير زياد و يا ساير نشانه‏هاي فساد كنترل شوند .

22. - ستروني 4-1- محيطهاي كشت و محلول‏هاي رقيق كننده - در اغلب موارد محيطها و محلول‏هاي رقيق كننده پس از توزيع در ظروف مناسب در دماي 121±1 درجه سلسيوس (فشار 245 كيلو پاسكال) به مدت 15 دقيقه سترون مي‏شود . در مواردي خاص مي‏توان طبق توصيه سازنده از دما و زمان مختلف استفاده نمود . در مورد محيطهائي كه نسبت به حرارت ناپايدار هستند ستروني با استفاده از صافي‏هاي سترون با اندازه روزنه حداقل 0/22 ميكرون انجام مي‏شود . 4-2- وسايل و تجهيزات - وسايل و تجهيزات فلزي , شيشه‏اي و يا ساير تركيبات مقاوم به حرارت به وسيله يكي از روش‏هاي زير سترون مي‏شود . 4-2-1- دماي خشك - در دماي 160±2 درجه سلسيوس به مدت حداقل 1/5 ساعت و يا در دماي 170±2 درجه سلسيوس به مدت حداقل يك ساعت . 2-4-2- دماي مرطوب - در دماي 121±1 درجه سلسيوس (فشار 245 كيلو پاسكال به مدت حداقل 20 بيست دقيقه .

23. 5- آماده‏سازي نمونه به منظور توزيع يكنواخت ميكروارگانيسم‏ها , بايد قبل از آزمون نمونه را با تكان دادن ظرف , كاملا مخلوط نمود . در صورتي كه ظرف حاوي نمونه بصورت كامل پر مي‏باشد , ابتدا مقداري از آن را تحت شرايط ستروني بيرون ريخته و سپس عمل مخلوط كردن را انجام دهيد . 6- شمارش در محيط جامد روش براساس برداشت حجم معيني از نمونه و تلقيح آن بر روي سطح و يا درون محيط كشت خاصي است . فرض براين است كه پس از گرمخانه‏گذاري هر ميكروارگانيسم تكثير يافته و ايجاد پرگنه قابل مشاهده در محيط كشت مي‏كند . روش كار مي‏تواند به سه صورت به شرح زير باشد : 6-1- روش مخلوط كردن نمونه با محيط كشت درون پليت - (پورپليت) 4 روش براساس مخلوط كردن حجم معيني از نمونه و يا رقتي از آن با محيط ذوب شده تا دماي نزديك به انجماد مي‏باشد . پس از گرمخانه‏گذاري پرگنه‏هاي روي سطح محيط و يا درون آن شمارش مي‏شود . 6-2- روش كشت سطحي - در اين روش حجم معيني از نمونه يا رقتي از آن روي سطح محيط كشت حاوي آگار گسترده مي‏شود و پس از گرمخانه‏گذاري كليه پرگنه‏هاي روي سطح محيط شمارش مي‏شود .

24. 6-3- روش صافي غشائي - روش براساس عبور دادن حجم معين نمونه از صافي است ميكروارگانيسم‏ها روي صافي باقي مي‏ماند سپس صافي روي محيط آگاردار و يا بالشتك جاذب 6 آغشته به محيط مايع قرار مي‏گيرد . پس از گرمخانه‏گذاري , پرگنه‏هاي روي سطح صافي‏ها شمارش مي‏شود . در مواردي كه جستجوي ميكروارگانيسم‏هاي بي هوازي موردنظر است , ابتدا صافي درون پليت قرار مي‏گيرد (به گونه‏اي كه سطح چهارخانه آن به طرف پائين باشد). و سپس با محيط حاوي آگار ذوب شده پوشانيده مي‏شود . حداكثر حجم نمونه آزمايشي بستگي به قابليت صاف شدن نمونه و صافي مورد استفاده دارد . در مورد آب آشاميدني حجم استاندارد براي صاف كردن نمونه 100/ ميلي ليتر است . با صافي‏هائي با اندازه 0/45 ميكرون 7 امكان صاف كردن چند ليتر آب وجود دارد كه در اين صورت روش آزمايش از حساسيت بالائي برخوردار است . -3-2- انتقال صافي - پس از برداشتن صافي باكمك پنس سترون آن را به يک پليت حاوي محيط آگار دار منتقل ميکنيم

25. 7- گرمخانه گذاري كليه پليت‏ها را به صورت وارونه درون گرمخانه قرار داد . زمان و دماي گرمخانه گذاري بسته به نوع ميكروارگانيسم مورد جستجو متفاوت بوده و ممكن است در دو مرحله انجام شود . - شمارش پس از پايان زمان گرمخانه گذاري پليت‏ها و صافي‏ها را سريعأ مورد بررسي قرار دهيد و در صورتي كه امكان بررسي سريع آن نيست . مي‏توان پليت‏ها را در دماي 4 تا 5 درجه سلسيوس حداكثر به مدت 24 ساعت نگه داري نمود . در مورد يك سري رقت متوالي پليتي را شمارش كنيد كه بين 25 تا 300 پرگنه دارد . براي محاسبه نتايج , از آنجا كه هر پرگنه از يك ميكروارگانيسم منشأ گرفته مي‏توان نتايج را به عنوان تعداد واحد پرگنه ساز 10 در حجم معين نمونه محاسبه نمود .

26. 10- شمارش و غني سازي بوسيله تلقيح در محيط كشت مايع روش براساس تلقيح حجم معيني از نمونه در محيط كشت مايع است تا از رشد ميكروارگانيسم‏هاي خاص اطمينان يابيم . كاربرد روش فوق در موارد زير است . 10-1- آزمون براي وجود يا عدم وجود ميكروارگانيسم‏ها - پس از تلقيح حجم معين در محيط كشت مايع و گرمخانه گذاري , با پيدايش تظاهرات ناشي از رشد ميكروارگانيسم مي‏توان به وجود يا عدم وجود آن در حجم معين نمونه پي برد . 10-2- آزمون براي غني سازي - در مواردي كه تعداد احتمالي باكتري در نمونه كم است و شمارش نيز مطرح نيست مي‏توان حجم معيني از نمونه را در محيط كشت مايع فاقد عوامل بازدارنده از رشد تلقيح نمائيد . پس از گرمخانه گذاري آن را به محيط كشت انتخابي جامد منتقل كنيد .

27. -3- آزمون براي شمارش - روش تخمين محتمل‏ترين تعداد .(N.P.M) 11 روش براساس نظريه احتمالات بوده و فرض براين است كه ميكروارگانيسم‏ها با يك توزيع يكنواخت و به صورت انتخابي در نمونه پخش شده‏اند . پس از تلقيح حجم‏هاي مختلف نمونه به لوله‏هاي حاوي محيط مايع و گرمخانه گذري , تغييرات ويژه اي ناشي از رشد باكتري‏ها مانند كدورت , توليد گاز , تغيير PH ظاهر خواهد شد . با در نظر گرفتن تعداد لوله‏هاي مثبت و با استفاده از جداول آماري مي‏توان بيشترين تعداد احتمالي باكتري‏ها را تخمين زد .

28. 11- انتخاب روش انتخاب روش آزمون آب به عوامل متعددي از جمله ويژگي‏هاي فيزيكي - شيميائي نمونه , و نوع ميكروارگانيسم مورد جستجو دارد . انتخاب روش در موارد مختلف به شرح زير است . 11-1- در مواردي كه آب حاوي ذرات معلق است , استفاده از روش صافي غشائي مناسب نمي‏باشد . (به علت مسدود شدن صافي‏ها توسط ذرات معلق و حتي موجودات زنده مانند ميكروپلانكتون‏ها) مسدود شدن روزنه صافي‏ها باعث كاهش عبور مواد غذائي از صافي شده و در نتيجه عدم تشكيل پرگنه مي‏شود). 11-2- در مورد آبهاي خيلي كدر روش .N.P.M تنها روشي است كه مي‏توان استفاده نمود .

29. 11-4- در مواردي كه مواد محلول در آب زياد است استفاده از روش صافي غشائي توصيه مي‏شود 11-5- در مواردي كه احتمال وجود بيش از 100 پرگنه روي هر صافي وجود دارد استفاده از روش صافي غشائي از حساسيت لازم برخوردار نمي‏باشد . 11-6- در مواردي كه تعداد ميكروارگانيسم‏ها در نمونه كم است ( كمتر از 100 عدد در هر ميلي ليتر ) استفاده از روش كشت سطحي مناسب نمي‏باشد . 11-8- در مورد آب‏هاي حاوي ذرات معلق استفاده از روش كشت ((مخلوط كردن نمونه با محيط كشت)) (پورپليت) به دليل شمارش ذرات به جاي پرگنه و ((روش كشت سطحي )) به دليل نداشتن حساسيت لازم مناسب نمي‏باشد . 11-10- به طور كلي روش .N.P.M به دليل تخميني بودن نسبت به روش شمارش در محيط جامد داراي دقت كمتري مي‏باشد . توصيه مي‏شود در صورت امكان به طور هم زمان از هر دو روش استفاده نمود .

30. جستجو و شمارش كليفرم ها در آب به روش چند لوله اي 1 ـ هدف هدف ارائه يك روش مرجع براي شناسائي و شمارش كليفرم‏ها , كليفرم‏هاي گرماپاي و اشريشياكلي فرضي در آب به وسيله كشت در محيط مايع به روش چند لوله‏اي و محاسبه بيشترين تعداد احتمالي 4 آنها در نمونه مي‏باشد . 2 ـ دامنه كاربرد اين استاندارد در مورد كليه آبها , حتي آبهايي كه داراي ذرات و مواد معلق هستند , كاربرد دارد .

31. 3 ـ تعاريف 3 ـ 1 ـ كليفرم‏ها : منظور ميكروارگانيسم‏هايي هستند كه مي‏توانند در شرايط هوازي در دماي350/5 و 370/5 درجه سلسيوس در محيط مايع لاكتوز رشد كرده و در مدت 48 ساعت توليد اسيد و گاز كنند . 3 ـ 2 ـ كليفرم‏هاي گرماپاي : منظور كليفرم‏هاي تعريف شده در بند 3 ـ 1 هستند كه قادرند در مدت 24 ساعت در دماي440/5 و44/50/25 درجه سلسيوس نيز توليد اسيد و گاز كنند . 3 ـ 3 ـ اشريشياكلي فرضي : منظور كليفرم‏هاي مقاوم به حرارت تعريف شده در بند 3 ـ 2 هستند كه قادرند در مدت 24 ساعت در دماي 440/5و 44/50/25درجه سلسيوس از تريپتوفان توليد اندول و از لاكتوز و مانيتول توليد گاز كند .

32. 4 ـ اساس روش 4 ـ 1 ـ تلقيح نمونه يا رقتي از آن به يك سري لوله‏هاي حاوي محيط مايع انتخابي لاكتوز . 4 ـ 2 ـ گرمخانه گذاري لوله‏ها در دماي 35 تا 37 درجه سلسيوس به مدت 24 تا 48 ساعت . 4 ـ 3 ـ تجديد كشت هريك از لوله‏هاي داراي كدورت و گاز مثبت به محيط انتخابي تأييدي . 4 ـ 4 ـ در مواردي كه جستجوي اشريشياكلي فرضي مورد نظر است , براي بررسي توليد اندول از لوله‏هاي فوق در يك محيط ترپتوفان دار كشت داده مي‏شود . در مورد بررسي كليفرم‏ها , محيطهاي تأييدي در دماي 25 تا 37 درجه سلسيوس به مدت 48 ساعت قرار مي‏گيرد و در مورد بررسي كليفرم‏هاي گرماپاي و اشريشياكلي فرضي در دماي 42 درجه سلسيوس به مدت 24 ساعت گرمخانه گذاري مي‏شود . سپس با استفاده از جداول آماري بيشترين تعداد احتمالي كليفرم‏ها , كليفرم‏هاي گرماپاي و اشريشياكلي فرضي در 100 ميلي‏ليتر از نمونه محاسبه مي‏شود . (از تعداد لوله‏هايي كه نتايج تأييدي مثبتي داشته‏اند).

33. 7 ـ روش كار 7 ـ 1 ـ آماده سازي : آماده سازي و تهيه رقت‏هاي مورد نياز را برطبق استاندارد ملي ايران به شماره 356 انجام 7 ـ 2 ـ گرمخانه گذاري : لوله‏هاي تلقيح شده را براي مدت 48 ساعت در دماي 350/5 يا370/5 درجه سلسيوس قرار دهيد . 7 ـ 3 ـ بررسي : پس از مدت 18 تا 24 ساعت لوله‏ها را بررسي نماييد . لوله‏هايي كه داراي كدورت همراه با توليد گاز و اسيد (در مورد محيطهايي كه داراي معرف PH هستند) هستند , به عنوان نتيجه مثبت در نظر بگيريد و لوله‏هايي را كه منفي بوده و يك يا تمامي تغييرات فوق را نشان نداده است , مجددا تا 48 ساعت در گرمخانه قرار دهيد .

34. 7 ـ 4 ـ آزمون‏هاي تاييدي : از آنجا كه واكنش مثبت در لوله‏هاي حاوي جدا ساز 5 تنها مربوط به كليفرم‏هاي فرضي است , بنابراين انجام آزمون تأييدي بر روي محيط كشت انتخابي اهميت داشته و ترجيحأ پرگنه‏هاي شاخص به مرحله آزمون تأييدي انتقال يابد . از هر يك از لوله‏هاي واكنش مثبت در يك يا چند لوله حاوي محيطهاي تأييدي) كشت دهيد تا توليد اندول و گاز مورد بررسي قرار گيرد . يادآوري 1: در صورتي كه جهت جداسازي از محيط ساده آبگوشت لاكتوز استفاده مي‏شود , توصيه مي‏گردد از دو محيط انتخابي‏تر تأييدي آبگوشت لاكتوز - صفرا - سبزدرخشان و اشريشياكلي براث نيز استفاده شود .

35. 7 ـ 4 ـ 1 ـ كليفرم‏ها : براي تاييد وجود كليفرم‏ها , توسط حلقه كشت از لوله‏هاي واكنش مثبت برداشت نموده و به لوله حاوي محيط آبگوشت لاكتوز - صفرا - سبزدرخشان تلقيح نماييد . لوله را در دماي 35 تا 37 درجه سلسيوس گرمخانه گذاري نموده و پس از 48 ساعت از نظر توليد گاز بررسي كنيد . 7 ـ 4 ـ 2 ـ كليفرم‏هاي گرماپاي : توسط حلقه كشت از لوله‏هاي واكنش مثبت برداشت نموده و به لوله حاوي محيط آبگوشت اشريشياكلي تلقيح نماييد . لوله را در دماي 44 درجه سلسيوس گرمخانه گذاري نموده و پس از 24 ساعت از نظر توليد گاز بررسي نمائيد . 7 ـ 4 ـ 3 ـ اشريشياكلي فرضي : توسط حلقه كشت از لوله‏هاي واكنش مثبت بند 7 ـ 3 برداشت نموده و به لوله حاوي محيط آب تريپتونه تلقيح نماييد . سپس لوله‏ها را به مدت 24 ساعت در دماي 44 درجه سلسيوس قرار دهيد . پس از پايان اين مدت مقدار 0/2 تا 0/3 از معرف كواكس به لوله‏ها اضافه نماييد . پس از تكان دادن لوله‏ها , ايجاد رنگ قرمز دليل بر حضور اندول است .

36. 7 ـ 5 ـ آزمون اكسيداز : برخي از ميكروارگانيسم‏هايي كه در آب يافت مي‏شوند , ممكن است در بسياري از جهات مشابه با كليفرم‏ها باشند . اين ميكروارگانيسم‏ها فقط در دماي كمتر از 37 درجه سلسيوس قادر به تخمير لاكتوز و توليد گاز هستند ولي از نظر آزمونهاي تأييدي منفي هستند و حضور آنها در آب حائز اهميت نمي‏باشد . گونه‏هاي آئروموناس نيز كه به طور طبيعي در آب وجود دارند , فقط در دماي 37 درجه سلسيوس يا كمتر از لاكتوز توليد اسيد و گاز مي‏كنند و موجب تداخل در روند آزمون مي‏شوند . اين ميكروارگانيسم‏هاي اكسيداز مثبت بوده و قابل تشخيص از كليفرم‏ها مي‏باشند . 7 ـ 5 ـ 1 ـ آزمون اكسيداز را با كشت خالص از باكتري تخميركننده لاكتوز كه روي محيط آگار مغذي رشد كرده است , به صورت زير انجام دهيد . - 2 يا 3 قطره از معرف اكسيداز را روي يك كاغذ صافي در يك پيليت قرار دهيد . - با استفاده از يك ميله شيشه‏اي , سواب يا سوزن كشت پلاتيني (نيكل و كروم نباشد) مقداري از پرگنه را روي كاغذ صافي قرار دهيد . - ظهور رنگ ارغواني مايل به آبي تيره در مدت 10 ثانيه را به عنوان واكنش مثبت درنظر بگيريد .

37. كيفيت آب- جستجو و شناسايي اشريشيا كلي و كلي فرمها قسمت اول : روش صافي غشايي هدف ، تعيين روش آزمون شناسايي و شمارش اشريشياكلي و كلي فرمها در آب بوسيلة صافي غشايي به دو روش((سريع)) و ((استاندارد)) ميباشد . 2 دامنه كاربرد اين استاندارد در مورد تمامي انواع آب به غير از موارد زير كاربرد دارد : 2-1 آبهايي كه حاوي مقادير قابل توجه ذرات و مواد معلق باشند، به گونهاي كه در عمل صافسازي ايجاد اختلال كند . 2-1آبهايي كه داراي تعداد زيادي از ميكروارگانيسمهاي ديگر باشند، به گونهاي كه رشد آنها مانع از شمارش دقيق كليفرمها شده و يا وجود آنها با فرايند صافسازي تداخل ايجاد كنند .

38. اصطلاحات و تعاريف در اين استاندارد اصطلاحات و / يا واژهها با تعاريف زير به كار ميرود : 4-1 باكتريهاي لاكتوز مثبت (روش استاندارد) منظور، باكتريهايي هستند كه در شرايط هوازي در دماي 3 ± 36 درجه سلسيوس بر روي محيط كشت انتخابي و افتراقي داراي لاكتوز رشد نموده، در مدت 3 ± 21 ساعت توليد اسيد كنند 4-2 كليفرم ها (روش استاندارد) منظور، باكتريهاي لاكتوز مثبت تعريف شده در بند 4-1 است كه اكسيداز منفي ميباشند . 4-3 اشريشيا كلي (روش استاندارد) منظور، باكتريهاي كلي فرم تعريف شده در بند 4-2 است كه در دماي 5/0 ± 44 درجهسلسيوس به مدت 3 ± 21 ساعت از تريپتوفان توليد ايندول كنند .

39. -1 روش استاندارد روش استاندارد براساس قرار دادن صافي غشايي بر روي محيط كشت انتخابي جامد لاكتوز دار و گرمخانه گذاري آن در دماي 3 ± 36 درجه سلسيوس بمدت 3 ± 21 ساعت ميباشد . كلنيهاي مشخص تشكيل شده در سطح صافي غشايي، بعنوان باكتري هاي لاكتوز مثبت شمارش مي شود. پس از انتخاب كلنيهاي مشخص و تجديد كشت آنها، آزمونهاي تأييدي شامل توليد ايندول و همچنين آزمون اكسيداز انجام ميگردد و سپس تعداد احتمالي باكتريهاي کلي فرم و اشريشياكلي در 100 ميليليتر نمونه محاسبه ميشود . 6 نمونهبرداري 6-1مقدار يك تا پنج ليتر آب را با رعايت شرايط زير نمونهبرداري كنيد :

40. آب - جستجو و شناسايي كليفرم ها به روش وجود - عدم وجود - روش آزمون ميكروبيولوژي مقدمه شناسايي باكتري هاي نشانگر يكي از بهترين راه ها براي ارزيابي كارائي روشهاي تصفية آب است . باكتر هاي كليفرم به دليل سرعت و سهولت جدا سازي و شناسايي ، شاخص ميكروبي مناسبيبراي تعيين كيفيت آب آشاميدني هستند اين باكتريها نبايد در آب آشاميدني تصفيه شده وجود داشته باشند . وجود باكتريهاي كليفرم در آب نشانگر فرآيند ناكافي و يا آلودگي پس از تصفيه است .

41. 1- Presence- Absence (P-A) Coliform test . يكي از روش هاي سادهبراي شناسايي كلــيفرم ها در آب روش آزمون وجود - عدم وجود كليفرم1 مي باشد. اين روش امكان آزمون تعداد زيادي از نمونه هاي آب را به طور همزمان فراهم مي كند 4-1 كليفرم ها گروهي از باكتري هاي هوازي و بي هوازي اختياري ، گرم منفي ، ميله اي شكل و بدون اسپور هستند كه قادرند در شرايط هوازي در محيط هاي كشت انتخابي لاكتوزدار در دماي 5/0 ± 35 درجه سلسيوس در مدت 24 تا48 ساعت توليد اسيد و گاز كنند .

42. 5 اساس روش اين روشبراساس تلقيح حجم معيني از نمونه آب به محيط انتخابي لاكتوز دار و گرمخانه گذاري در دماي 5/0 ± 35 درجه سلسيوس انجام مي پذيرد . سپس با استفاده از محيط هاي كشت انتخابي و تائيدي ، وجود كليفرم ها تائيد مي شود . 6 نمونه برداري دست کم 500 ميلي ليتر آب را (طبق استاندارد ملي 4208) سال 1376 آئين کار نمونه برداري از آب جهت آزمونهاي باکتريولوژي نمونه برداري كنيد . 7-1-1 آبگوشت P-A1 1-P-A broth 2طرز تهيه : تركيبات فوق را با جوشاندن در آب مقطر حل نمائيد . سپس به حجم هاي 50 ميلي ليتر در ظروف شيشه اي با گنجايش 250 ميلي ليتري ريخته ، و در اتوكلاو با دماي 1 ± 121 درجه سلسيوس به مدت 12 دقيقه سترون كنيد . pH نهايي محيط بايد 2/0± 8/6 باشد.

43. روش اجراي آزمون 9-1 تلقيح نمونه نمونه مورد آزمــون را به مــدت 5 ثانــيه بشدت تكان دهيد. سپس 100 ميلي ليتر از آن را به 50 ميلي ليتر محيط كشت آبگوشت P-A بند 7-1-1 با غلظت سه برابر تلقيح نموده و پس از يكنواخت شدن ، در دماي 5/0 ± 35 درجه سلسيوس به مدت 24 تا 48 ساعت گرمخانه گذاري نمائيد . 9-2 بررسي نمونه نمونه تلقيح شده بند 9-1 را پس از پايان زمان گرمخانه گذاري بررسي كنيد . مشاهده رنگ زرد درمحيط کشت آبگوشت P-Aنشانگر تخمير لاكتوز و توليد اسيد و گاز همچنين حباب گاز است. كه با تكان دادن ظرف به آرامي حباب گاز و کف را مي توانيد در سطح آن مشاهده كنيد. توليد اسيد و گاز نشانگر وجود احتمالي كليفرم ها در نمونه مورد آزمون مي باشد كه براي تائيد آن بايد آزمون تائيدي انجام پذيرد .

44. 9-3 آزمون تائيدي براي تائيد وجود كليفرم ها ، با استفاده از حلقه کشت سترون ، از كشت بند 9-2 که توليد اسيد و گاز نموده اند ، برداشت نموده و به محيط كشت آبگوشت لاكتوز - صفرا - سبز درخشان بند 7-1-2 انتــقال داده و در دماي 5/0± 35 درجه سلسيوس به مدت 24 تا 48 ساعت گرمخانه گذاري نمائيد. مشاهده گاز و کف در محيط فوق ، نشانگر وجود باكتري هاي كليفرم در نمونه مورد آزمون مي باشد . 10 بيان نتايج نتايج را بصورت "" كليفرم ها در 100 ميلي ليتر نمونه آب وجود دارد "" و يا "" كليفرم ها در 100 ميلي ليتر نمونه آب وجود ندارد "" بيان كنيد .

45. روش شمارش بيشترين تعداد احتمالي اشريشياكلي با استفاده از MUG روش شمارش بيشترين تعداد احتمالي 1 اشريشيا كلي 2 با استفاده از (MUG) 3 1 - هدف هدف از تدوين استاندارد ارائه روش براش شمارش اشريشيا كلي با استفاده از MUG ميباشد . كلي فرم‏هاي ديگر را نيز با اين روش ميتوان شمارش نمود .

46. 3 - تعريف 3-1- اشريشياكلي : در اين استاندارد , منظور از اشريشيا كلي باكتري گرم منفي از خانواده انتروباكترياسه است كه ميتواند در دماي 30 درجه سلسيوس تركيب MUG را شكسته و تركيبي با خاصيت فلوئورسانس ايجاد نمايد . اين باكتري همچنين قادر به توليد اندول از تريپتوفان ميباشد . 3-2- كلي فرم‏ها : نام غير رسمي براي تعدادي از باكتريهاي گرم منفي كه به خانواده انتروباكترياسه تعلق دارند . در اين استاندارد منظور از كلي فرم‏ها , كليه باكتريهاي گرم منفي بدون اسپوري هستند كه در درماي 30 درجه سلسيوس تا مدت حداكثر 48 ساعت ميتوانند لاكتوز را تخمير , گاز توليد نموده و نيز پرگنه‏هاي مشخص بر روي محيط جامد بند (6-2) ايجاد كنند .

47. 4 - اساس و روش تركيب 4 - متيل آبلي فريل بتا - د - گلوكورونيد توسط آنزيم بتا - د - گلوكورونيداز 4 شكسته شده و تركيب حاصل متيل آمبلي فرون ماده است كه زير لامپ ماوراي بنفش با طول موج 366 نانومتر خاصيت فلوئورسانس از خود نشان ميدهد . لامپهاي ماورابنفش با طول موج كوتاه مناسب نميباشند . 94 درصد از سويه‏هاي اشريشياكلي اين خاصيت را از خود نشان مي‏دهند . - آزمايش توليد اندول از تريپتوفان براي شناسايي اشريشياكلي بر روي همان محيطي كه حاوي MUG است انجام مي‏گيرد .

48. منابع 1 – استاندارد ملي ايران ويژگي ميكروبي آب آشاميدني شماره 1011 2 – استاندارد ملي ايران روش نمونه برداري آب شماره 2347 3 - استاندارد ملي ايران روش نمونه برداريآب شماره 2348 4- استاندارد ملي ايران روش شمارش بيشترين تعداداحتمالي اشريشيا كلي با استفاده از MUG شماره 3456 5- “ “ “ جستجو و شمارش كلي فرم ها در آب به روش چند لوله اي شماره 3759 6 – “ “ “ جستجو و شمارش كلي فرم ها در آب به روش غشايي شماره 3760 7 – “ “ “ آيين كار آزمون هاي باكتريولوژيكي آب شماره 4207 8 – “ “ “ آيين كار نمونه برداري از آب جهت آزمون هاي ميكروبيولوژي شماره 4208 9 – “ “ “ كلي فرم ها –كيفيت آب جستجو وشناسايي اشريششيا كلي -صافي غشايي 7725-1 10- “ “ “ آب – جستجو وشناسايي كلي فرمها به روس وجود- عدم وجود روش آزمون ميكروبيولوژي شماره 7725 مركز بهداشت شهرستان شيراز – آزمايشگاه آب و فاضلاب-رحيم دواني mug