1 / 30

Genotoxicitás

Genotoxicitás. Genotoxicitási tesztek Bakteriális reverz mutáció teszt In vitro mikronukleusz teszt. A genotoxicitás szintjei Kromoszóma típusú mutációk (szerkezeti, számbeli változás) Pontmutációk. egy vagy néhány bázis: - cseréje - kiesése - beékelődése.

jackie
Download Presentation

Genotoxicitás

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript


  1. Genotoxicitás Genotoxicitási tesztek Bakteriális reverz mutáció teszt In vitro mikronukleusz teszt

  2. A genotoxicitás szintjei Kromoszóma típusú mutációk (szerkezeti, számbeli változás) Pontmutációk egy vagy néhány bázis: - cseréje - kiesése - beékelődése silent, missense, nonsense frame-shift, leolvasási keret eltolódása A genotípus megváltozása nem mindig vezet a funkció (fenotípus) megváltozásához (silent=csendes mutációk, mutáció nem kódoló régióban) A mutáció lehet: káros, semleges, előnyös

  3. Mutagén – Karcinogén • a mutagén fizikai vagy kémiai ágens, mely növeli a mutációk képződésének gyakoriságát • indukált mutáció a mutagének által okozott változások a genetikai állományban • a halálozások oka a civilizált világban 40%-ban rákos daganat • - a rákos megbetegedések közel 90%-át a környezetünket szennyező mutagének okozzák • - a mutagén vegyületek nagy része rákkeltő (karcinogén) is !!!!!!!!!!!! • - évente néhány ezer olyan vegyületet állítanak elő, amelyek korábban nem léteztek a Földön (gyógyszer alapanyagok, növény- vagy faanyagvédő szerek, élelmiszer-adalék, kozmetikum, háztartási vegyszer stb.) • a mutagének és a karcinogének közötti szoros kapcsolat szükségessé teszi a környezetünkben lévő mutagén vegyületek kimutatását

  4. Spontán mutációk • okai : • a bázisok alternatív formái (keto/enol, amino/imino tautomerizáció) • a replikáció során a szálak elcsúszása következtében kisméretű inszerciók és deléciók keletkezése • - a DNS szerkezeti változásai (depurináció és deamináció, amelyek a bázisok párosodási tulajdonságait változtatják meg)

  5. Tautomerizáció Normál bázispárosodás (keto és amino formák) A guanin enol formája timinnel, az adenin imino formája pedig citozinnal képes H-híd kialakítására. A citozin imino formája adeninnel, a timin enol formája pedig guaninnel képes H-híd kialakítására. A párosodási hiba a replikáció során az újonnan szintetizált szálban megmarad és állandósul

  6. Indukált mutációk • külső okokból származó mutációk • vegyszerek számos módon okozhatnak mutációkat: • bázis analógok a DNS-be beépülnek, de nem a megfelelő bázissal párosodnak • alkiláló, deamináló szerek, oxidáló anyagok a DNS bázisok szerkezetét és párosodási tulajdonságait megváltoztatják • interkaláló szerek a bázisok közé ékelődnek és nukleotid inszerciót vagy deléciót okoznak

  7. Bázis analógok a természetes bázisokhoz hasonló szerkezetűek, a DNS polimeráz a kettős spirálba beépíti pl. 5-brómuracil (5BU) timin analóg adeninnel és guaninnal is (!) képes párosodni tranziciót okoz T-A>5BU-A>5BU-G>C-G C-G>5BU-G>5BU-A>T-A 2-aminopurin (2AP) adenin analóg a timinen kívül citozinnal is (!) képes párosodni tranziciót okoz T-A>T-2AP>C-2AP>C-G C-G>C-2AP>T-2AP>T-A

  8. Alkiláló szerek alkil (-CH3, -CH2-CH3) csoportokat építenek a nukleinsavak bázisaira és azokat módosítják pl. etil-metánszulfonát (EMS) főként a guanint, kisebb mértékben a timint módosítja a 6-etilguanin timinnel párosodik, ami C-G>T-A tranzíciót eredményez a 4-etil-timin a guaninnal párosodik, és így T-A>C-G tranzíció jön létre

  9. Deamináló szerek a spontán deamináción kívül különböző vegyszerek is képesek a bázisok amin csoportjait támadni pl. salétromossav a citozint, az adenint és a guanint támadja citozin uracil, mely a következő replikáció során adeninnel párosodik és C-G > T-A tranziciót okoz adenin hipoxantin, ami citozinnal párosodva T-A > C-G tranziciót eredményez guanin xantin, ez elsősorban citozinnal, de kisebb mértékben timinnel is párosodva C-G > T-A tranziciót hoz létre hidroxilamin a citozin amino csoportját támadja, és hidroxilaminocitozin keletkezését okozza a hidroxilaminocitozin adeninnel párosodik, és C-G > T-A tranziciót okoz

  10. Interkaláló vegyületek - általában gyűrűs vegyületek, melyek térkitöltése a bázispárokhoz hasonlít - a DNS kettős spirálban egymás melletti bázispár közé képesek beépülni - a beépülés a kettős spirál alakját torzítja, ami azután a replikáció során egy nukleotid kiesését vagy beépülést okozza pl. proflavin akridin sárga etidium-bromid dioxin

  11. A genotoxicitás mérése • többféle, nemzetközileg elfogadott tesztrendszer: • bakteriális tesztek (Salmonella typhimurium, Esherichia coli) • eukarióta egysejtűek (pl. Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus nidulans) • élesztőgombapenészgomba • rovarok (ecetmuslica Drosophila melanogaster) • gerincessejt-vonalak (humán és egyéb emlős sejtvonalak) • növények (lóbab, árpa, vöröshagyma) • in vivo (egér, hörcsög, patkány)

  12. Alternatív (= in vitro) genotoxicitási tesztek • állatkísérletek számának csökkentése • gyors (short term study) • - költséghatékony • Végpontok: • pontmutáció • DNS törés • repair (DNS szintézis NEM az S fázisban) • kromoszóma aberrációk

  13. Mutációk detektálása • - a fajok nemzedékről nemzedékre mutatott állandósága arra utal, hogy a mutációk bekövetkezése ritka esemény • a valóságban azonban a megfigyelhetőnél jóval több mutáció keletkezik • körülbelül 1,000,000,000,000,000,000 (1018) DNS sérülés minden felnőtt emberben naponta! • kb. 30.000.000.000 (3x1010) sejtünk van . . . (~3x107/nap/sejt) • mivel leggyakoribbak a recesszív mutációk, a legtöbb új mutáció észlelését a dominancia megakadályozza • az új mutációk észlelése ezért a legegyszerűbb a haploid szervezetekben • diploidokban a mutációk kimutatására speciális rendszerek szükségesek • - amutációk gyakorisága alacsony, ezért mutánsokat nagy egyedszámú populációból lehet kimutatni

  14. Bakteriális reverz mutagenitási teszt • Kidolgozója, Bruce Ames utánAMES teszt • Validált (OECD Guideline 471) • Pontmutációk észlelésére alkalmas • Több humán genetikai betegség pontmutációkra vezethető vissza. • Baktérium törzsek: auxotróf mutánsok • Salmonella typhimurium: his- : hisztidint és biotint igényel • Escherichia coli: trp- : triptofánt igényel • - nem képesek minimál táptalajon növekedni • megnövelt mutációs érzékenység: • megnövekedett sejtfal áteresztő képesség • DNS hibajavító rendszer kiküszöbölése • metabolikus aktiválás kell: S9 frakció : • patkány májából készült enzimkivonat • a baktériumok nem rendelkeznek oxidatív metabolizáló enzimrendszerrel Nagy populációban bekövetkező ritka mutációs esemény detektálására alkalmas

  15. Abaktériumok által képzett telepek Salmonella E. coli

  16. Reverzió = back mutáció trp+ Triptofánt szintetizál Triptofánmentes tápközegben életképes trp- Triptofán bioszintézisére képtelen Csak triptofánt tartalmazó tápközegben életképes Salmonella typhimurium his- mutánsainak reverzióját figyelik a tesztelendő vegyületek hatására Reverzió = back mutáció his+ Hisztidint szintetizál Hisztidinmentes tápközegben életképes his- Hisztidin bioszintézisére képtelen Csak hisztidint tartalmazó tápközegben életképes Escherichia coli trp- mutánsainak reverzióját figyelik a tesztelendő vegyületek hatására

  17. A teszttörzsek jellegzetességei • Különböző típusú his mutációkat tartalmaznak, ezért a mutáció reverziója történhet: • bázispár szubsztitúcióval • frame-shift segítségével • különböző hatásmechanizmusú mutagén vegyületek mutathatók ki, azaz információt nyújt a • genotoxikus anyagok által előidézett mutációk típusáról

  18. A kísérlet kivitelezése

  19. A kísérlet kivitelezése S9 – patkány májából készült enzimkivonat S9-et adagolva modellezni lehet az emlősökben lezajló enzimatikus reakciókat, így a bakteriális géntoxikológiai tesztekből következtethetünk a szennyezőanyagok magasabb rendű szervezetekre gyakorolt hatására

  20. Pozitív kontroll ellenőrzése

  21. Az eredmények értékelése • A kísérleti anyag mutagénnek tekinthető, ha: • A kísérleti anyaggal kezelt lemezek revertánsszámai a kontroll lemezek revertánsszámaihoz képest koncentrációfüggő növekedést mutatnak • A revertánsszámok reprodukálható, biológiailag jelentős növekedést mutatnak legalább egy koncentrációcsoportban, legalább egy baktériumtörzsnél metabolius aktiváló rendszer hozzáadásával vagy anélkül • Törzsek: TA 1535, TA100, TA98, TA 1537 és TA 102 vagy E. coli WP2uvrA • Biológiailag jelentős: törzsenként változik (2-szeres, 3-szoros) • Statisztikai értékelés nem szükséges

  22. Továbbfejlesztett Ames teszt (Ames II) 96 lukú mikrotitráló lemezen 6 törzzsel (TAMix) végezhető egyszerre pH indikátor festék a tápközegben (brómkrezol lila) A hisztidinmentes tápközegben szaporodó (revertált) baktériumok savasítják a tápközeget Lila: nem mutáns Sárga: back-mutáns

  23. In vitro mikronukleusz teszt Validált (OECD Guideline 487) Kromoszóma mutációk kimutatására alkalmas Kb 80% egyezés a kromoszóma aberráció teszttel, érzékenyebb, olcsóbb, gyorsabb Mikronukleusz: a sejtmagnál kisebb méretű, membránhatárolt DNS darabok, amelyek a citoplazmában jelennek meg a sejtosztódás zavara esetén

  24. In vitro mikronukleusz teszt Citotoxikus ágensre adott sejtválasz:

  25. In vitro mikronukleusz teszt Citotoxikus ágensre adott sejtválasz:

  26. In vitro mikronukleusz teszt - acentrikus kromoszóma fragment – klasztogén anyag - centromérral rendelkező fragment – aneugén anyag (a) a mikronukleusz acentrikus kromoszóma fragmensből származik (b) a mikronukleusz egész kromoszómát tartalmaz A klasztogén anyagok törést okoznak a DNS-ben, így az osztódás során kromoszóma fragmentek veszhetnek el, vagyis mikronukleusz képződhet belőlük. Az aneugén anyagok olyan változást okoznak a sejtosztódásnál, ami aneuploidiához vezet. Az aneuploidia a normális diploid kromoszómaszámtól való eltérés, vagyis például egy teljes kromoszóma elvesztése, avagy mikronukleusszá való alakulása.

  27. A mikronukleusz képződés módjai

  28. A mikronukleusz képződés módjai

  29. A mikronukleusz képződés módjai A genetikai anyag a sejtmembrán felé áramlik. Ezek szerint a mutagén anyaggal való expoziót követően először a sejtmag alakja változik meg, bimbózni kezd, majd a sejtmagból kizárt DNS darabkák mikronukleusz formát öltenek, és ezt követően még a sejtből is kizáródhatnak mini sejt formájában. A: exponált sejt B: metafázis C: poliploid metafázis D: poliploid sejtmag E: szabálytalan sejtmag F: bimbózó sejtmag G: szabálytalan sejtmag és mikronukleusz H: szabálytalan sejtmag és mini sejt

  30. In vitro mikronukleusz teszt A kísérlet kivitelezése sejtek felszaporítása kísérleti anyag koncentráció sorával való kezelés, kontrollok rátenyésztés citokelazinB hozzáadásával a tenyésztés terminálása kicseppentés, festés, fedés A kísérlet értékelése mikronukleált binukleáris sejtek összes sejthez való viszonyítása morfológiai kritériumok: MN<sejtmag/3 jól szeparált, nem bimbózó azonos festődési intenzitás a sejtmaggal

More Related