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氨基酸分析

氨基酸分析. 1958 Spackman, Stein and Moore 第一次实现氨基酸自动分离和定量. NH2 R C COOH H. UV-210nm. 氨基酸衍生化方法. 柱后衍生 柱前衍生. 氨基酸. 试剂. 检测器. 色谱柱. 衍生化后的氨基酸. 检测器. 色谱柱. 柱后衍生. 试剂. 氨基酸. 检测器. 色谱柱. 色谱柱 : 阳离子交换柱 试剂 : 茚三酮方法 --- UV/VIS 检测器 OPA 方法 --- 荧光检测器. 柱后衍生化分离柱. 阳离子交换柱

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Presentation Transcript

  1. 氨基酸分析 • 1958 Spackman, Stein and Moore 第一次实现氨基酸自动分离和定量 NH2 R C COOH H UV-210nm

  2. 氨基酸衍生化方法 • 柱后衍生 • 柱前衍生 氨基酸 试剂 检测器 色谱柱 衍生化后的氨基酸 检测器 色谱柱

  3. 柱后衍生 试剂 氨基酸 检测器 色谱柱 色谱柱 : 阳离子交换柱 试剂 : 茚三酮方法 --- UV/VIS 检测器 OPA方法 --- 荧光检测器

  4. 柱后衍生化分离柱 阳离子交换柱 使用阳离子交换柱，峰分离度较差。 分析所有的氨基酸所需时间较长。 • 蛋白质水解氨基酸 (45 min) • 生物体氨基酸(120 min)

  5. 茚三酮方法 伯氨基酸和仲氨基酸（亚氨基酸） 检 测: 440nm ( 脯 氨 酸) or 570nm (primary) 反应温度: 130 ℃ 反应速度: 快 速 试剂稳定性: 不稳定（ 必须冷藏） 衍生化产物稳定性: 稳定

  6. 茚三酮方法 柱温箱 反应器加热器 氨基酸 130 ℃ UV/VIS 检 测 器 阳离子交换柱 茚三酮试剂

  7. OPA 方 法( 邻 苯 二 甲 醛) 伯氨基酸 检 测：荧光检测器(Ex=350nm, Em=460nm) 反应温度： 室 温 反应速度： 快 速 试剂稳定性: 较 差 衍生化产物稳定性： 较 差

  8. 脯氨酸和羟基脯氨酸分析 • 脯氨酸和羟基脯氨酸不与OPA试剂 发生反应 • 在与OPA反应前两种氨基酸应先使 用下列试剂进行氧化 • 次氯酸盐 • 氯胺－T

  9. OPA 衍生反应辅助试剂 • 有硫醇存在时，OPA才会与伯氨基酸发生反应 乙硫醇 2- 硫基乙醇 3- 硫基丙酸 ( 非挥发性)

  10. OPA 方 法 柱温箱 氨基酸 荧光检测器 阳离子交换柱 次氯酸盐 OPA 试剂

  11. 茚三酮方法和OPA方法比较

  12. 柱前衍生 衍生化后的氨基酸 检 测 器 色 谱 柱 色 谱 柱: 反相柱(ODS) 试 剂: OPA ( 荧光检测) FMOC (荧光检测) 荧 光 胺(荧光检测) DANS-Cl (荧光检测) PITC (UV)

  13. 柱前衍生分离柱 反相色谱柱(ODS) 使用反相柱，色谱峰分离良好。 分析某些类型的氨基酸所需时间很短 • 蛋白质水解氨基酸(20 min) • 生物体氨基酸(60 min)

  14. OPA Method(o-phthaldialdehyde) 伯氨基酸 检测: 荧光检测器(Ex=380nm, Em=420nm) 反应温度：室温 反应速度：快速

  15. OPA柱前衍生化色谱图 生物体氨基酸标准品 Shim-pack CLC-ODS

  16. FMCO 方法(9-fluorenylmethyoxycarbonyl chloride) 通用试剂，用于缩氨酸 N端保护

  17. 荧光胺方法 • pH＝7时与伯氨基酸快速反应 • 易于水解

  18. DANS-Cl 方法(1-dimethylaminonaphthalene-5-sufonyl chloride) • 与伯氨基酸和仲氨基酸反应效率低

  19. PITC 方法(phenylisothiocyanate) • For peptide and protein sequencing as Edman抯 reagent • 伯氨基酸和仲氨基酸 (碱性条件) • 反应时间长 • 使用UV检测器，灵敏度低 PITC PTC

  20. PTC - 氨基酸色谱图 氨基酸标准品 STR ODS-II

  21. 自动氨基酸分析仪 • 对于“ 柱前”和“ 柱后”自动氨基酸分析仪来说，采用何种方法更好？ • 要控制反应时间，采用柱后衍生方法更方便。 这就是为什么采用柱后衍生法所得结果之重复性更好的原因。 • 柱后衍生重复性, RSD 约为 1% • 柱前衍生重复性, RSD > 2%

  22. Shimadzu 氨基酸分析系统

  23. 氨基酸分析流程图

  24. 分离柱 • 强酸性阳离子交换树脂 (带有磺化基团的苯乙烯－二乙烯基苯共聚物) • Na型 and Li型 • Shim-pack AMINO-Na ，用于水解氨基酸分析 • Shim-pack AMINO-Li ，用于生物体氨基酸分析

  25. 水解氨基酸色谱图

  26. 生物体氨基酸色谱图

  27. 流动相 [ Na型 ] A 溶液 : 0.2N 柠檬酸钠 (用高氯酸调 pH至3.2) B 溶液 : 0.6N 柠檬酸钠 / 0.2M 硼酸 (用4M NaOH调pH至10.0) C溶液 : 0.2N NaOH(用于清洗色谱柱) [ Li 型] A 溶液 : 0.15N 柠檬酸锂 / 7% 甲氧基乙醇 (用硼酸调 pH至2.6) B溶液 : 0.3N 柠檬酸锂 / 0.2M 硼酸 用4M LiOH调pH至10.0) C 溶液 : 0.2N LiOH (用于清洗色谱柱)

  28. PH梯度 H H H R-C-COOH R-C-COOH R-C-COO- NH3+ NH2 NH2 分离是通过 离子力进行的

  29. N-acetylcystine作为辅助试剂

  30. 什么是氨捕集柱? 无捕集柱 流动相中的氨 有捕集柱

  31. 重复性 (各250 pmol) (n=10)

  32. 线性

  33. 高灵敏度分离色谱图 25 pmol 氨基酸标准品

  34. 样品预处理 • 脱脂 • 去蛋白 • 蛋白质水解 • 样品稀释 • 过滤

  35. 脱脂 • 脂类组分会影响分析柱 • 使用弱极性溶剂 • 乙酸乙酯 • 氯仿 • 正己烷等 • 两相分离后, 水相必须使用0.45 um 滤膜过滤

  36. 除蛋白 • 蛋白组分会干扰氨基酸的分离 • 除蛋白试剂 • 酸性溶剂方法 • 有机溶剂方法 • 超滤方法 • 蛋白沉淀物必须采用离心 (3000 rpm, 5 min) 或过滤方法除去.

  37. 酸性溶剂方法 • 三氯乙酸 (5-10% 水溶液) • 高氯酸 (0.1 - 1% 水溶液) • 除去蛋白后, 通过加 NaOH or LiOH 以中和溶液 (溶液呈酸性时会影响色谱保留时间.)

  38. 有机溶剂方法 乙腈 乙醇 聚苯乙烯柱不适合用有机溶剂。 如果采用有机溶剂方法, 进样量应尽可能小。

  39. 超滤方法 • 效率高 • 成本低

  40. 老鼠血清中游离氨基酸分析

  41. 牛尿中游离氨基酸分析

  42. 猪血粉中游离氨基酸分析

  43. 茶叶中游离氨基酸分析

  44. 蛋白质水解 (1) 高氯酸水解方法 • 6N - HCl 110C (N2氛围) 22 - 72 hours • 色氨酸, 半胱氨酸,蛋氨酸分析不能用此水解方法 (可用其它方法). • 天冬酰胺酸和 谷氨酸 转换成酸的形式。

  45. 蛋白质水解 (2) 碱水解方法 • 4N NaOH 110C (N2 氛围) 16 - 24 hours • 这一方法用于色氨酸

  46. 蛋白质水解 (3) 过甲酸氧化方法 • A/B=5/95 110C (N2 氛围) A:30% 过氧化氢 B:90% 甲酸 22 - 72 h • 这一方法用于 半胱氨酸、胱氨酸和蛋氨酸分析

  47. 盐酸水解方法实例 从胰腺得到的胰岛素中 的水解氨基酸分析

  48. 氨基酸残留基团测定值和理论值比较

  49. 碱水解方法实例 意大利草中水解氨基酸分析

  50. 过甲酸氧化方法实例 人发中水解氨基酸分析

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