Biologie moléculaire

1. Biologie moléculaire Dans la vie d’un biologiste

2. Cas clinique hépatite C • Mr X , 47 ans,effectue bilan préopératoire • Le bilan biologique montre: • NFS normale • ALAT , ASAT: 2 x la normale • AgHBs – • Anti-HBs:+ • Sérologie hépatite C positive

3. Examens complémentaires à pratiquer • ARN • Génotypage • Sérotypage viral • Charge virale hépatite C • Électrophorèse des protéines • Bêta 2 microglobuline • Bilirubine

4. Examens complémentaires • ARN: Témoin de la réplication: • 20% hep C sont ARN négatif • Plus sensible que la charge virale: • Amplicor: 50UI • CV amplicor: 600 à 850 000UI • bDNA: 615 à 7 700 000 UI Mais PCR en temps réel sensibilité: 15UI

5. Examens complémentaires • Sérotypage ou génotypage: idem , indispensable pour mise sous traitement • Sérotypage ne donne pas sous type (1,2….) Mais pas d’influence sur le traitement • Génotypage est plus précis • Traitement et suivi sont conditionnés par le génotype

6. Examens complémentaires à pratiquer • Charge virale hépatite C • ARN • Génotypage • Sérotypage viral • Électrophorèse des protéines • Bêta 2 microglobuline • Bilirubine

7. Génotypage se fait par: • Séquençage région NS3 • Séquençage région NS5 • INNO LIPA • PCR en temps réel

8. Génotypage • Région 5’ NC le plus fréquent , quelquefois pas sous-typage • NS5: plus de variabilité • INNO LIPA: Bonne technique, facile • PCR en temps réel: avenir!!!!!!!!!

9. Génotypage se fait: • Séquençage NS3 • Séquençage NS5 • INNO LIPA • PCR en temps réel

10. Décision médicale: Mise sous traitement

11. Avant traitement • Charge virale • Détection de mutations de résistance au traitement par séquençage

12. Avant traitement • Charge virale: • Indiquée pour génotypes 1,4,5 • Pas nécessaire pour génotypes 2 et 3 • Recherche de mutations de résistance: - Pas de nouvelles molécules : antiprotéases???

13. Avant traitement • Charge virale • Détection de mutations de résistance au traitement par séquençage

14. Suivi pendant traitement • ARN mensuel • Charge virale hebdomadaire • Transaminases hebdomadaires • ARN à M6 • NFS mensuelle • Hormones thyroïdiennes

15. Suivi pendant traitement • Génotype 1: charge virale à S12 (consensus 2002) ou à S4 (2006) • Génotypes 2 et 3: ARN à M6 • Transaminases tous les mois • NFS tous les mois • Hormones thyroïdiennes: TSH tous les 3 mois

16. Suivi pendant traitement • ARN mensuel • Charge virale hebdomadaire • Transaminases hebdomadaires • ARN à M6 • NFS mensuelle • Hormones thyroïdiennes

17. Suivi post traitement • ARN mensuel • Charge virale bi-annuelle • ARN à M6 puis 1 an • Génotypage • Séquençage pour mutations de résistance

18. Suivi post traitement • ARN mensuel • Charge virale bi-annuelle • ARN à M6 puis 1 an • Génotypage • Séquençage pour mutations de résistance

19. Hépatite B • Mr C , origine asiatique , arrivé en France depuis 6 mois consulte en gastro-entérologie HAV totaux pos HAV IgM: neg Ag HBs pos Anti-HBc pos avec IgM neg Ag HBe neg Anti-HBe pos Hépatite C neg

20. Examens complémentaires à demander • ADN B • Sérologie hépatite delta • ADN delta • Génotypage Hépatite B • Anti-HBs

21. Examens complémentaires à demander • ADN B : indispensable • Facteur de gravité : hépatite delta 5% AgHBs sont infectés par delta • Virus delta: pas de technique commerciale mais techniques de RT-PCR maison et maintenant PCR en temps réel • Génotypage ???

22. Examens complémentaires à demander • ADN B • Sérologie hépatite delta • ADN delta • Génotypage Hépatite B • Anti-HBs

23. ADN B • bDNA • PCR classique • PCR en temps réel • TMA • bDNA détecte 25 UI/L

24. Techniques ADN b • bDNA • linéarité : 615 à 7,7 millions UI/ml • Amplicor • Linéarité: fonction de la dilution (galère!!!!!!!!) • Sensibilité: 200UI/ml • PCR temps réel Linéarité : 54 - 110 millions UI/ml 12 – 50 millions UI/ml Sensibilité : 12 UI/ml soit 70 copies/ml

25. ADN B • bDNA • PCR classique • PCR en temps réel • TMA • bDNA détecte 25 ui

26. Décision thérapeutique • Patient est mis sous Lamivudine • avec une charge virale à 8800 UI/ml

27. Suivi Médical sous traitement • ADN B mensuel • NFS hebdomadaire • Charge virale hépatite delta • AgHBs mensuel

28. Suivi Médical sous traitement • ADN B trimestriel • ALAT trimestrielle • Si négativation de l’ADN, faire un AgHbS • La négativation de l’ag HBs est rare sous lamivudine , • 5 à 10% sous interféron

29. Suivi Médical sous traitement • ADN B mensuel • NFS hebdomadaire • Charge virale hépatite delta • AgHBs mensuel

30. Au bout de 6 mois , la charge virale par bDNA est < 350UI/ml • Après 2 ans de traitement , la charge virale est de 10000 UI/ml

31. Quels examens doit on pratiquer? • Génotypage • Charge virale hépatite delta • Ag Hbe • Recherche mutant C/préC • Recherche mutation YMDD

32. Traitements • Interféron + peg –interféron • Analogues nucléosidiques: • Lamivudine :3TC • Emtricitabine: Emtriva • Adefovir: Hepsera • Tenofovir: Viread • clevudine • entecavir

33. Incidence des résistances • Lamivudine: 24% en 1 an 70% en 4 ans • Adefovir 15% en 4 ans • ceci en monothérapie • Intérêt des bi ou trithérapies????

34. Incidence des résistances • mutation YMDD : la + fréquente , mutation de résistance à la lamivudine, emtricitabine • Pas de résistance croisée entre les différents nucléosidiques et nucléotidiques

35. Terminal protein spacer Pol/RT RNaseH 349 (rt1) 845 a.a. 1 183 692 (rt344) GVGLSPFLLA YMDD I(G) II(F) A D E B C L180M M204V/I/S LAM L801 V173L N236T ADV A181V I169T M250V ETV S184G M202I LdT M204I TDF V1911I A194T

36. Quels examens doit on pratiquer • Génotypage • Charge virale hépatite delta • Ag HBe • Recherche mutant C/préC • Recherche mutation YMDD

37. Recherche de résistance à la Lamivudine • Séquençage • Hybridation moléculaire • PCR en temps réel • Phénotypage antivirogramme

38. Recherche de résistance à Lamivudine • Séquençage • Hybridation moléculaire • PCR en temps réel • Phénotypage antivirogramme