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TSH 荧光酶免疫检测法

TSH 荧光酶免疫检测法. 佛山市新生儿疾病筛查中心 刘海平. 一、先天性甲低的新生儿筛查方法. 1 、 酶免疫分析法 ( enzymelmmunoassay，EIA) 2、 放射免疫分析法 ( radioimmunoassay，RIA) 3、 免疫放射法 ( immunoradiometricassay，IRMA). 一、先天性甲低的新生儿筛查方法. 4、 时间分辨荧光免疫分析法 TRFIA me-resolvedfluorescenceimmunoas—say

jariah
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TSH 荧光酶免疫检测法

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Presentation Transcript

  1. TSH荧光酶免疫检测法 佛山市新生儿疾病筛查中心 刘海平

  2. 一、先天性甲低的新生儿筛查方法 • 1、酶免疫分析法 (enzymelmmunoassay，EIA) • 2、放射免疫分析法 (radioimmunoassay，RIA) • 3、免疫放射法 (immunoradiometricassay，IRMA)

  3. 一、先天性甲低的新生儿筛查方法 • 4、时间分辨荧光免疫分析法 TRFIAme-resolvedfluorescenceimmunoas—say • 5、荧光酶免疫分析法FEIAfluoreseenceenzymeimmunoassay • 6、自动新生儿疾病筛查系统(automatednewbornscreeningsystem)

  4. TSH荧光酶免疫分析法 Fluorescence enzyme immunoassay FEIA

  5. 1、原 理

  6. 1．原理 • 荧光酶免疫分析法(FEIA)是一种高度灵敏的检测方法，用FEIA测定血hTSH基于一步夹心法原理，采用固相、双位点荧光酶免疫分析法。

  7. 被测TSH抗原有两个抗原决定簇 故叫双位点 被测TSH抗原 β位点 α位点

  8. 包被在反应板上的 TSH单克隆抗体 故叫固相 TSH单克隆抗体 TSH单克隆抗体 TSH单克隆抗体

  9. 辣根过氧化物酶(HRP)标记的 抗hTSH—亚基（ β位点）的第二抗体 HRP HPR标记的抗TSH 亚基单克隆抗体

  10. 1．原理 • 干血斑中洗涤出的hTSH，同时与包被在酶标板上抗hTSH的单克隆抗体分子和辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗hTSH—亚基的第二抗体结合。

  11. 打入血斑（TSH）并加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗hTSH—亚基的第二抗体溶液于已包被TSH单克隆抗体的酶标反应孔内。（一步法）打入血斑（TSH）并加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗hTSH—亚基的第二抗体溶液于已包被TSH单克隆抗体的酶标反应孔内。（一步法） PH：6.5 HRP HRP 被测TSH抗原 HPR标记的抗TSH 亚基单克隆抗体 HPR标记的抗TSH 亚基单克隆抗体 被测TSH抗原 HRP 被测TSH抗原 被测TSH抗原 HRP HPR标记的抗TSH 亚基单克隆抗体 HPR标记的抗TSH 亚基单克隆抗体 被测TSH抗原 TSH单克隆抗体 TSH单克隆抗体 TSH单克隆抗体

  12. 干血斑中洗涤出的hTSH，同时与包被在酶标板上抗hTSH的单克隆抗体分子和辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗hTSH—亚基的第二抗体结合。 被测TSH抗原 HRP HPR标记的抗TSH 亚基单克隆抗体 被测TSH抗原 HRP 被测TSH抗原 HPR标记的抗TSH 亚基单克隆抗体 被测TSH抗原 HPR标记的抗TSH 亚基单克隆抗体 HRP HRP 被测TSH抗原 HRP HPR标记的抗TSH 亚基单克隆抗体 HRP HPR标记的抗TSH 亚基单克隆抗体 HPR标记的抗TSH 亚基单克隆抗体 被测TSH抗原 被测TSH抗原 TSH单克隆抗体 TSH单克隆抗体 TSH单克隆抗体

  13. 过量的酶结合物和未结合的hTSH被洗涤去掉。 只剩下TSH同时与包被在酶标板上抗TSH的单克隆抗体和辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗TSH—亚基的第二抗体结合物。 被检测TSH抗原被夹在中间，故又称夹心法。 HRP HRP HRP HPR标记的抗TSH 亚基单克隆抗体 HPR标记的抗TSH 亚基单克隆抗体 HPR标记的抗TSH 亚基单克隆抗体 被测TSH抗原 被测TSH抗原 被测TSH抗原 TSH单克隆抗体 TSH单克隆抗体 TSH单克隆抗体

  14. 加入荧光底物3-P-羟基苯丙酸(HPPA)和双氧水进行酶反应。加入荧光底物3-P-羟基苯丙酸(HPPA)和双氧水进行酶反应。 PH：7.8 HPPA HPPA H2O2 H2O2 H2O2 HPPA H2O2 HRP HRP H2O2 HRP H2O2 HPPA HPPA HPPA HPPA H2O2 HPR标记的抗TSH 亚基单克隆抗体 HPR标记的抗TSH 亚基单克隆抗体 HPR标记的抗TSH 亚基单克隆抗体 H2O2 HPPA HPPA H2O2 HPPA 被测TSH抗原 被测TSH抗原 被测TSH抗原 H2O2 TSH单克隆抗体 TSH单克隆抗体 TSH单克隆抗体

  15. 作用1小时 2HPPA+H2O2 DPDPA+2H2O HRP DPDPA 2HPPA H2O2 2H2O 无荧光 3-P-羟基苯丙酸 荧光物质

  16. 原理 • 以甘氨酸缓冲液终止酶反应，同时使荧光增强。 DPDPA DPDPA 甘氨酸缓冲液 PH：10.3

  17. 原理 • 用荧光读数仪以320nm为激发光，405nm为发射光测定荧光值。由于荧光强度与酶标反应板上结合的hTSH数量成正比，因此，通过已知浓度的标准血斑荧光值和样本的荧光值，也就可换算出样本血斑中hTSH的含量。 • 用TSH荧光酶免 疫分析法FEIA检 测hTSH的灵敏度 达0.037mIU／L

  18. 特点： • ①荧光物质为DPDPA，是由HPPA与双氧水在HRP的作用下脱氢结合而成，它吸收特定波长（320nm）的光能后，发生原子重排，同时发射出更长波长（405nm）的光。 发射光 波长405nm 激发光 波长320nm DPDPA

  19. 特点： • ②鉴于HPPA（3-P-羟基苯丙酸）敏感性高、动力学范围广，已被广泛用于替代传统EIA显色剂，作为辣根过氧化物酶的底物。以HPPA作底物的FEIA可检测极低和极高浓度，具有明显优势，由于hTSH样本正常值与非正常值之间差异大，故该法特别适用于hTSH检测。

  20. 特点： • ③HPPA／H2O2反应生成的荧光强度的影响因素中，最重要的是底物浓度、反应液和终止液的pH值。酶反应最佳pH值为7.8。加入碱性缓冲液终止酶反应，又可显著增强荧光强度。经测定，使用pH10.3、1.5 mol／L甘氨酸缓冲液可获得最大荧光强度。在低浓度hTSH下，该缓冲液可使荧光强度增加5倍，当hTSH浓度高于80mIU／L时，增强作用依次减弱。

  21. 特点： • ④荧光产物稳定，可放置过夜后测定。无论在室温(20～25℃)或30℃孵育用FEIA测定hTSH的敏感性无变化；而在37℃条件下孵育会增加背景荧光，降低灵敏度。建议底物孵育温度为20～30℃。

  22. 特点 • ⑤FEIA检测法方法先进，重复性高。 • 一般情况下，批内分析变异系数和批间分析变异系数均小于10％。

  23. 特点 • ⑥应用FEIA法进行hTSH检测时，其他垂体激素和人绒毛膜促性腺激素(HCG)对实验的干扰极小。

  24. 2、仪器和试剂

  25. 以下仪器均由芬兰Labsystems公司提供 3 m m 打孔器 荧 光 读数仪 电 脑 显示屏 孵 育 振荡仪 八 道 加样器 单 道加样器 自 动 洗板仪

  26. (1)、仪器： • ①、荧光读数仪；②、孵育／振荡仪；③、自动洗板仪；④、3mm打孔器，或打孔钳；⑤、加样器；八道加样器。以上仪器均由芬兰Labsystems公司提供。⑥、3mm实验血片塑料支架；⑦、电脑、打印机；⑧、冰箱。

  27. 材料 • ①、新生儿筛查滤纸干血斑标本：用S&S903滤纸，按新生儿疾病筛查滤纸干血斑标本采集方法采集；

  28. 试剂 芬兰LabsystemshTSH-FEIA试剂盒，包含如下物品 酶结合物稀释液（3） 终止液（5） 洗涤液（6） H2O2溶液（4b） HPPA荧光底物（4a） 抗hTSH—HRP酶结合物（2） 抗hTSH包被的酶标板（1）

  29. 3、实验操作

  30. 实验操作步骤 • (1)用自动编码机给每一张血片按次序盖上卡片号，此卡片号也就是我们的检验编号。 • 在检验前，所有的试剂和酶标反应板应放置室温平衡30分钟。

  31. 实验操作步骤 • (2)做好实验登记，包括检测日期、检测区间、复查样本号等。 • 编写好实验操作卡；把本次实验要做的标准、质控、复查标本、重查标本及常规标本的卡片号在电脑中用不同的颜色的字打印出来，看上去一目了然，严防打孔时张冠李戴。

  32. 佛山市新生儿疾病筛查中心实验操作卡 检测项目: TSH检测时间: 2004年11月11日 操作者： 试剂批号：163ZC1 标准浓度：1、9、20、44、66、87。 质控批号：163ZC1 范 围：①高值：14-37，中值26。②低值：0-5，中值3.0。

  33. 实验操作步骤 • （3）对照操作卡在滤纸血斑上打下直径3mm的标准品(双孔)、质控物(品)(双孔)和标本，并依次放置到抗hTSH包被的酶标板孔内。注意：为避免层析效应，应围绕血样点中央对称地打孔。

  34. 血斑打孔的位置 打孔时要选择合格的血斑，同时要选择合适的地方，两面都要看一下。由于层析效应中心位比周边位的 浓度要高10%左右。 正确 太靠边 太中心

  35. 实验操作步骤 打孔 加酶标液 洗板 加底物液 加终止液 检测

  36. 4、结果计算

  37. 结果计算 • 测量结束后，可利用电脑工作软进行自动处理绘制标准曲线，推荐使用线性坐标，选择光滑曲线。也可使用手工计算。从标准曲线上读取质控物和标本的TSH浓度。在试剂盒中均应有质控物(品)和其期望值，只有当质控物(品)测定值在其范围内，该次实验才能视为合格。

  38. 结果计算 • 发出实验报告。 • 做好结果的登记。 • 保存好结果的原始资料。

  39. 5．注意事项

  40. 注意事项 • 在洗板时，应先直接洗一次，再甩掉血片，再洗四次即可。不可先甩掉血，这样不但血片甩不干净，而且高浓度的 酶污染了反应板，很难洗干净。造成不明原因的假阳性。当然如用自动打孔机打孔用塑料支架则避免了这种情况。 HRP

  41. 注意事项 • 切值的确定不可一刀切，应根椐具体情况而而定。一般8～20mIU/l。 • 因为每个医院采血的质量不可能完全一至（采血时间、送到时间、血片干燥程度等） • 很明显冬天做出的结果要此夏天做出的结果普遍高，故切值应相应增高。

  42. 注意事项 • 血片的溶解 • 有些血片血斑大而饱满。但在反应液里过了一夜还浮在面上，而且中间有黑心，则是溶解较差，遇此类血由切值需降低。有的则全黑，反应液全清，属不溶解，要重采。

  43. 注意事项 • (1)所用试剂需正确储存，不恰当的保存方式可能造成荧光背景增加，标准曲线斜率降低，进而影响实验精确度。试剂一般储存在2—8℃。 • (2)勿使用过期试剂。 • (3)不同批次试剂不可混合或互换。 • (4)开始检测前，把试剂盒内所用的试剂和酶标板放置室温平衡30分钟。 • (5)建议每块酶标板都使用标准品和质控物(品)，并作双孔。 • (6)勿互换试剂瓶盖。

  44. 注意事项 • (7)从试剂瓶中转移液体时，使用无菌的移液管以避免污染，否则由于试剂污染可能产生不正确的结果。 • (8)检测一旦开始，随后的步骤应连续地进行下去，不要中断。 • (9)加样时勿接触孔壁，以避免孔间交叉污染。(10)孵育时间的轻微变化是允许的，首次孵育和二次孵育许可时间分别为：3小时土10分钟和1小时土5分钟。 • (11)使用过夜孵育过程，实验结果可获得较高的重复性。 • (12)空气的洁净度可能影响实验结果。

  45. 谢谢！

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