（三）蛋白质的提取和分离纯化

1. （三）蛋白质的提取和分离纯化 • 提取通常是指用适当的溶剂和方法，从原料中把有效成分分离出来的过程。

2. 大多数蛋白质可溶于水、稀盐、稀酸、稀碱的水溶液。部分与脂类结合的蛋白质可溶于乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂中。大多数蛋白质可溶于水、稀盐、稀酸、稀碱的水溶液。部分与脂类结合的蛋白质可溶于乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂中。

3. 1.水溶液提取 • 稀盐(0.15mol/L)和缓冲溶液对蛋白质溶解度大,稳定性好,是常用的蛋白质提取液.5°C以下操作,防止热变性. • 同时加蛋白质水解酶抑制剂-碘乙酸 • 控制pH在等电点附近.

4. 2.有机溶剂提取 • 与脂类结合的蛋白质,分子中含有非极性侧链的蛋白质不溶于水、稀盐、稀酸、稀碱的水溶液,但可溶于乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂中。 • 3.表面活性剂提取 • 用非离子型表面活性剂可以提取水盐系列无法提取的蛋白质和酶,但随后分离困难,要小心使用.

5. 蛋白质的分离纯化p218 • 如测单一结构蛋白，则必须分离纯化。 • 为了研究某一个蛋白质的结构，必须首先将该蛋白质 从其他蛋白质和非蛋白质分子中纯化出来。用于分离蛋白质的最重要特性有大小、电荷、疏水性和对其他分子的亲和性。通常采用多种方法的组合来实现蛋白质的完全纯化 .

6. 纯化方法（见218－226） • 1. 沉淀法 • 2. 色谱法 • 3. 电泳法 • 4. 离心法 • 5. 膜分离法 • 6. 双水相系统萃取法

7. 1.沉淀法 • 盐析法、PEG沉淀法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、热处理沉淀法

8. （1）盐析法 • 蛋白质水溶液加入盐的浓度对蛋白质的溶解度有显著影响. 低浓度的盐能增加对蛋白质的溶解度,称为盐溶; 当盐的浓度增加时,蛋白质的溶解度下降并析出,称为盐析.这是由于高浓度的盐离子易与水结合,夺取了蛋白质的水化层,使蛋白失水,凝聚并沉淀析出 • 不同蛋白质盐析所需的离子强度不同，盐析法就是建立于此的分离方法。

10. 盐析时常用的盐是硫酸铵,它溶解度大(515g/L),应用范围广,不易引起蛋白质变性.血浆中蛋白质盐析的例子硫酸铵浓度 沉淀的蛋白质 占总蛋白质的比例g/100mL % 20 纤维蛋白 428-33 优球蛋白 3 40-46 假球蛋白 2450以上 清蛋白 69盐析沉淀后的蛋白质需要用透析法脱盐

11. （2）PEG法 • 聚乙二醇是水溶性非离子型聚合物，记做PEG-XX. XX表示平均分子量，越高的粘度越大，沉淀蛋白质所需用量越少，但低分子量PEG选择性更强。 • 沉淀相关因素：PEG的聚合度、PEG浓度、蛋白质分子量、蛋白质浓度、介质pH值、介质离子强度、温度。 • PEG易吸收水分，是沉淀机理。

12. （3）有机溶剂沉淀法 • 有机溶剂的加入使介质的介电常数下降，使蛋白质分子间静电作用力增强；同时有机溶剂还可降低蛋白质分子表面的水合程度，从而导致沉淀。常用有机溶剂是乙醇和丙酮。 • 有机溶剂能使蛋白质变性，一般低温下操作，加入适量中性盐。 • 某些金属离子可使蛋白质在有机溶剂中溶解度降低。

13. （4）等电点沉淀法 • 蛋白质在水溶液中一般以离子态溶于水,在等电点时电荷为零,消除了分子间的静电斥力，但由于水膜的存在，蛋白质仍有一定的溶解度而沉淀不完全，所以等电沉淀法经常与盐析法或有机溶剂沉淀法联合使用。单独使用等电点法主要是用于去除等电点相距较大的杂蛋白。 • 此时蛋白质沉淀析出.不同的蛋白质等电点不同,据此可对蛋白质提取物进行初步分离.

14. （5）热变性沉淀 • 多数蛋白质都易热变性，所以可通过加热使杂蛋白变性沉淀而被除去，用于纯化热稳定酶。

15. 2.色谱法 • 常用的有：排阻色谱、离子交换色谱、亲和色谱、疏水色谱、经典的吸附色谱等。

16. （1）凝胶过滤色谱 • Sephadex 交联葡聚糖凝胶 缓冲液中加盐防蛋白吸附 • Bio-Gel 聚丙烯酰胺凝胶 可分辨分子量只相差5000Da的蛋白质 • Sepharose 琼脂糖凝胶 湿态提供 • Fractogel TSK 合成的亲水乙烯基凝胶过滤材料

17. 凝胶过滤色谱的流动相 • 使用以水做基体具有不同pH值的多种缓冲溶液做流动相。 • 流动相中加入少量无机盐，维持流动相的离子强度为0.1-0.5，以消除体积排阻色谱法中不希望存在的吸附作用与基质的疏水作用。

18. 体积排阻色谱的影响因素 • 填料。化学键合的硅胶和亲水树脂凝胶。 • 柱长。分离度与柱长的平方根成正比。60－120cm对于蛋白质的分离比较理想。 • 洗脱液。pH值接近中性 • 流速。小于0.1ml/min • 样品容量。样品浓度0.01~0.5%;蛋白质样品体积为柱体积的1～3％ • 蛋白质在变性洗脱条件下的分离

19. （2）离子交换色谱 • 葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、纤维素在蛋白质纯化中最常用。前二者交换容量大。 • 二乙基氨基乙基（DEAE）常用于分离中性或酸性蛋白质。高于pH值为9时，需用三乙基氨基乙基（TEAE）。中性或碱性蛋白质常用羧甲基纤维素（CM）色谱分离。低于pH值为3时，需用磺酸乙基（SE）或磺酸丙基（SP）基团。

20. 离子交换色谱的流动相 • 多以水溶液为流动相 • 组分的保留值和分离度主要是通过控制流动相的pH值和离子强度来调节的 • 增加流动相中盐的浓度，组分的保留值降低。 • 离子交换色谱中，常用NaNO3来控制流动相的离子强度。

21. 离子交换色谱的影响因素 • 填料孔径的影响。高效离子交换色谱采用大孔径填料。 • 柱长。对分离度影响小。 • 流速。增加流速会恶化传质，线性流速应为0.1mm/s • pH值的影响。 • 离子强度的影响。

24. 阴离子交换剂用英文字头A，阳离子交换剂的英文字头是C。英文字后面的数字表示Sephadex(葡聚糖凝胶)型号。阴离子交换剂用英文字头A，阳离子交换剂的英文字头是C。英文字后面的数字表示Sephadex(葡聚糖凝胶)型号。 • G后面的阿拉伯数字是凝胶的吸水率(mL／g干胶)乘以10。 • 吸水量越大，孔径越大，可分离的蛋白质分子量越大。

25. 磺丙基 阳离子交换剂

26. 要考察的因素或者说准备进行优化的项目： 交换容量； 缓冲溶液pH值； 缓冲液的离子强度；

27. 交换容量 p42 • 交换容量是指离子交换剂能提供交换离子的量，它反映离子交换剂与溶液中离子进行交换的能力。 • 影响交换容量的因素 ：一方面是离子交换剂颗粒大小、颗粒内孔隙大小以及所分离的样品组分的大小等的影响。另一些影响因素如离子强度、pH值等主要影响样品中组分和离子交换剂的带电性质。

31. 缓冲液的pH值 • 蛋白质在离子交换色谱中分离的基础是用pH值来控制蛋白质的电荷。如果流动相的pH值高于蛋白质的等电点（pI)，它将带有净的负电荷；若流动相pH值低于蛋白质pI，则显示净的正电荷。pI高的蛋白质最好在阳离子交换柱上分离，pI低的蛋白质可选择阴离子交换柱。

37. 缓冲液的离子强度 • 在流动相中，盐的类型和pH值一样重要，这两个因素共同控制着蛋白质在离子交换色谱柱上的保留行为、分离度和回收率。 • 蛋白质的带电特征和离子化决定了蛋白质在离子交换柱上参数的变化。 • p154

41. 葡聚糖凝胶阳离子交换树脂

42. 最终确定的条件 • 凝胶柱规格： 2．6×20 cm；洗脱条件：1 M醋酸 • 盐离子线性梯度为0～1 M NaC1；流速：68 mL／h；检测波长：220 nm； • 样量：400 mg分别收集6个不同组分并测定它们的降血压活性

43. （3）亲和色谱法 • 固定相：载体——配体 • 配体具有两个基本条件：与被纯化的物质有强的结合力；有与基质（载体）共价结合的基团 • 分辨率高、收率亦高 • 洗脱：用配体的竞争物或提高盐浓度、升高温度等

44. （4）疏水色谱 • 水溶液中的蛋白质分子表面氨基酸残基的非极性侧链密集一起形成的疏水区。 • 依据疏水吸附剂与蛋白质疏水区间相互作用的强弱，可达到分离蛋白质的目的。

45. 电泳法 • 不但可用于蛋白质的纯化，还常用于蛋白质纯度鉴定及理化性质测定。 • 最常用的分离纯化方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦等。

46. 离心法 • 是分离细胞器及各种大分子基本手段。 • 转速10~25kr/min的离心机称为高速离心机。 • 转速>25kr/min，离心力>89Kg者称为超速离心机。 • 超速离心机的最高转速可达100000r/min，离心力超过500kg。

47. 左上：普通台式离心机。 左下：冷冻台式离心机。右：超速离心机。

48. 普通和高速离心机主要用于分离制备生物大分子物质和亚细胞成分；普通和高速离心机主要用于分离制备生物大分子物质和亚细胞成分； • 超速离心机则兼有制备性离心和分析离心两种功能，由于转速高会产生大量的热量，因而这种离心机都附有冷冻装置，以降低转子室内温度。

49. 制备离心 (preparative cetrifugation)  分析离心 (analytical centrifugation)  根据分离的对象和目的不同，超离心技术可分为两大类： 用于制备和纯化亚细胞成分和大分子，目的是制备样品 分析和测定制剂中大分子的种类和性质(浮力密度和分子量等)

50. S为沉降系数(秒)； R为沉降颗粒到转头中心的距离(半径，cm)； ω为角速度，以每秒转动的弧度表示； t为时间(秒)。