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MARCATORI POLIMORFICI DEL DNA

MARCATORI POLIMORFICI DEL DNA. Restriction Fragment Length Polymorphism ( RFLP ) (Studi di associazione) Variable Number of Tandem Repeats ( VNTR ) Minisatelliti (Diagnostica forense) Microsatelliti (Studi di associazione e diagnostica forense)

jimbo
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MARCATORI POLIMORFICI DEL DNA

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Presentation Transcript


  1. MARCATORI POLIMORFICI DEL DNA Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) (Studi di associazione) Variable Number of Tandem Repeats (VNTR) Minisatelliti (Diagnostica forense) Microsatelliti (Studi di associazione e diagnostica forense) Single Nucleotide Polymorphism (SNP) (Studi di associazione anche per caratteri quantitativi)

  2. ENZIMI DI RESTRIZIONE 1) Sequenza di riconoscimento (da 4 a 8 basi) detta palindrome: rispetto ad un asse di simmetria esiste la stessa sequenza di basi su entrambi i filamenti quando questi vengono letti in direzione 5’- 3’; 2) Sporgenze al 5’ o al 3’; 3) Estremità coesive o non coesive; 4) Isoschizomeri (enzimi diversi che riconoscono la stessa sequenza); 5) Enzimi con sequenze di riconoscimento diverse ma che creano estremità compatibili (isoschizomeri) (es: BamHI e MboI).

  3. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) Polimorfismo per lunghezza di frammenti di restrizione

  4. Identificazione di RFLP attraverso Southern blot

  5. Identificazione di RFLP attraverso Southern blot

  6. Identificazione dell’allele S per la falcemia attraverso un RFLP nel gene beta della globina

  7. Un locus 1 Un altro locus 2 Un altro locus 3 MINISATELLITI Sequenze ripetitive ipervariabili disperse nel genoma principalmente nei telomeri (9-64 bp in blocchi da 0,1 a 20 kb). Variabilità inter-individuale dovuta al numero di ripetizioni in tandem Esempio: Sequenza GGGCAGGAXC (core) simile alla sequenza “chi” di E. coli, segnale per la ricombinazione generalizzata

  8. Uso del fingerprint del DNA per scopi medico-legali (minisatelliti di Jeffreys) (A) test di paternità (B) test per casi di violenza sessuale

  9. MICROSATELLITI o STR (SHORT TANDEM REPEATS) Simple sequence repeats (1-5 bp) disperse nel genoma (blocchi inferiori a 100 bp) Variabilità inter individuale per numero di ripetizioni in tandem

  10. Microsatelliti analizzati con PCR e gel di acrilammide

  11. Eredità di microsatelliti in una famiglia

  12. Microsatelliti amplificati con PCR multiplex e analizzati con sequenziatore Marcatura di un primer di ogni PCR con diverso fluoroforo

  13. Microsatelliti amplificati con PCR multiplex e analizzati con sequenziatore

  14. Microsatelliti analizzati con sequenziatore

  15. Fingerprinting genetico mediante microsatelliti 1 sbagliato!

  16. IDENTIFICAZIONE DEL SESSO MEDIANTE PCR Y-SPECIFICA

  17. MAPPA CROMOSOMICA DEI GENI AmelX E AmelY Primo esone del gene AmelY più lungo di 6 basi rispetto al gene AmelX. Nel maschio: due bande di 106bp (AmelX) e 112bp (AmelY). Nella femmina: due bande sovrapposte di 106bp (AmelX). Amelogenina: proteina presente nello smalto dei denti

  18. Single Nucleotide Polymorphism (SNP) Solitamente 2 alleli Frequenti nel genoma (1 ogni kb) Tasso mutazione: ca 10-9 Tipizzazione con procedura automatizzata 1000 Genomes Project: identificati oltre 11 milioni di SNP

  19. Single Nucleotide Polymorphism (SNP) Soggetto eterozigote C/T

  20. APLOTIPO Specifica combinazione di due o più alleli di marcatori del DNA situati vicino l’uno all’altro sulla stessa molecola di DNA. I polimorfismi per singolo nucleotide (SNP) sono i marcatori più frequenti utilizzati per costruire aplotipi. Gli aplotipi si generano per caso quando una serie di mutazioni strettamente associate si accumulano nel corso del tempo in cromosomi discendenti da un cromosoma ancestrale

  21. FORMAZIONE DI APLOTIPI NEL CORSO DI UN TEMPO EVOLUTIVO Comparsa di 2 mutazioni Comparsa di 3 mutazioni Diversi per 5 SNP

  22. APLOTIPO introne esone 3’ UTR Locus genico +/- +/- +/- Alleli RFLP C/T A/G C/T Alleli SNP Popolazione A Aplotipi RFLP Aplotipi SNP - + + 1 + + + 2 + - - 3 1 C G C G C 2 T T A C 3 C A C 4

  23. Ricerca geni malattia in popolazioni isolate Tutti (o quasi) i malati hanno una regione aplotipica identica che circoscrive il gene responsabile della malattia

  24. MAPPATURA RISPETTO AD APLOTIPO CON MARCATORI MICROSATELLITI DEL DNA Possibile localizzazione gene malattia Rispetto ai marcatori sul braccio lungo del cromosoma, il gene patologico mappa prossimalmente rispetto a S129.

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