Problematika makroskopického barvení mozkových řezů pro výukové účely

1. Školitel: MUDr. Petr Hájek, Ph.D. Ústav anatomie Lékařská fakulta v Hradci Králové Univerzita Karlova v Praze Problematika makroskopického barvení mozkových řezů pro výukové účely Jana Nohejlová Studentská vědecká konference 14.5.2013

2. Úvod • Barvené mozkové řezy jsou užitečnou pomůckou při výuce neuroanatomie • Cílem barvení je zvýraznit kontrast mezi bílou a šedou hmotou

3. Historický přehled • Sincke (1926) – berlínská modř • Mainland (1928) – delší trvanlivost barvy • Mulligan (1931) – ochranný film • Modifikace: Green (1933), Tompsett (1956), Gregg (1975), … • Le Masurier (1935) • Hewitt (1959) – barvení bílé hmoty (Sudan) • Braak (1978) – Astra Blue; Heller, Stoddard (1986) – Alcian Blue • Alston (1981) • Wu, Kiernan (2001) - tetrasodná sůl kyseliny Cu-ftalocyanin tetrasulfonové (CPTS) • Loftspring et al. (2008) - CPTS bez použití zahřátého fenolu

4. Makroskopické barvení mozkových řezů na ústavu anatomie LF HK • Modifikace Mulliganovy barvicí metody dle Le Masuriera (1935), naposledy úspěšně použita v roce 2003 • Setření ostrého kontrastu mezi bílou a šedou hmotou

5. Makroskopické barvení mozkových řezů dle Le Masuriera provedené v letech 2003 a 2010

6. Cíl práce • Zjistit příčinu selhání Le Masurierovy metody • Zvolit vhodnou alternativní barvicí techniku • Aplikovat barvení také na tkáně fixované v alkoholovém roztoku

7. Materiál a metody I • Fixované lidské mozky darované pražským psychiatrickým pracovištěm v roce 2003 (dále označeny jako „mozky Praha”) • Lidské mozky fixované ve formalínu v r. 2012 • Lidské mozky fixované v letech 2010-12 v alkoholovém roztoku (etanol, glycerol, formalín, aceton a voda v poměru 14:1:3:3:8)

8. Materiál a metody II • Le Masurierova metoda (Le Masurier, 1935): • 2 min ponoření mozkových řezů do Mulliganova roztoku (40 g krystalického fenolu, 5 g síranu měďnatého, 1,25 ml 0,1M kyseliny chlorovodíkové v 1 litru destilované vody) při 60-65ºC • 2 min oplach pod tekoucí vodou • 2 min v 1% roztoku chloridu železitého • 2 min oplach pod tekoucí vodou • 2 min v 1% roztoku ferrokyanidu draselného • 8 h oplach pod tekoucí vodou

9. Materiál a metody III • Alstonova metoda (Alston, 1981): • 20 min v Mulliganově roztoku při pokojové teplotě • 20 s ve směsi xylen/polyclens* (100:1 V/V) • 10 s ve 2% roztoku hydroxidu sodného • 2 min ve 2% roztoku ferrokyanidu draselného • 8h oplach pod tekoucí vodou * Polycell Polyclens Trade Brush Cleaner byl v pokusu nahrazen Rokoředidlem UNI RK002 na základě dostupnosti a odpovídajícího složení

10. Faktory, které mohou ovlivnit barvicí proces: • Věk dárce (Roberts a Hanaway, 1969) • Poškození bílé hmoty (Mainland, 1928, Blair, 1932) • Přítomnost krve • Druh a délka fixace, refixace • Krájecí nástroje, materiál nádob • Čistota, objem a koncentrace chemikálií • Reakční časy • Chemické složení a teplota vody, délka oplachu

11. Výsledky I mozek č. 1 mozek č. 2 10% formalín

12. Výsledky II Le Masurier, strana A dvojnásobná koncentrace CuSO4, strana A Le Masurier, strana B dvojnásobná koncentrace CuSO4, strana B

13. Výsledky III: Alston „mozky Praha“ bez oplachu s oplachem 3 m. 3 měsíční fixace 1 m. 1 měsíční fixace „mozky Praha“

14. Výsledky IV - Alston alkoholová fixace

15. Alstonova vs. Le Masurierova metoda Alston Le Masurier „mozky Praha“ nově fixované mozky

16. Závěr • Le Masurierova metoda se v posledních letech jeví z neznámých důvodů v místních podmínkách jako nespolehlivá • Alstonova metoda je adekvátní náhradou, je dostatečně účinná i v případě alkoholové fixace • Mozky darované ústavu anatomie v r. 2003 nejsou pro barvení vhodné

17. 1.série mozkových řezů barvených Alstonovou metodou zařazená do výuky

18. Poděkování • doc. MUDr. Dáša Slížová, CSc. • MUDr. Petr Hájek, Ph.D. • MUDr. Filip Caisberger • MUDr. Petr Hejna, Ph.D., MBA • Ing. Pavel Šiman, CSc., MUDr. Pavel Tomšík, Ph.D. • p. Jarmila Slezáková, laborantky ústavu anatomie

19. Použitá literatura (vybrané tituly) • Alston RL. A batch staining method for brain slices allowing volume measurements of gray and white matter using an image analyzing computer (Quantimet 720). Stain Technol 1981; 56: 207-213. • Hewit W. A method for staining whole brains for gross and macroscopic study. J Anat 1959; Vol 93: 134-136. • Le Masurier HE. Simple method of staining macroscopic brain sections. Arch NeurPsych 1935; 34(5): 1065-1067. • Loftspring MC et al. Selective gray matter staining of human brain slices: optimized use of cadaver materials. Biochem Histochem 2008; 83(3):173-7. • Mulligan JH. A method of staining the brain for macroscopic study. J Anat 1931; Vol 65: 468-472. • Suriyaprapadilok L, Withyachumnarnkul B. Plastination of Stained Sections of the Human Brain: Comparison between Different Staining Methods. J Int Soc Plastination 1997; Vol 12, No 1: 27-32. • Wu M, Kiernan JA. A new method for surface staining large slices of fixed brain using a copper phthalocyanine dye. Biotech Histochem 2001; 76(5-6):253-5.