מודיפיקציות בהיסטונים

1. בס"ד מודיפיקציות בהיסטונים סמינריון שנה ב' – גישות מחקר בביולוגיה חישובית מגיש: אלחנן אלבוחר מנחה: פרופ' ניר פרידמן

2. על מה נדבר? • מודיפיקציות בהיסטונים, השערת 'הקוד ההיסטוני' • מיפוי של אצטילציה בשמרים, התאמה לשעתוק, הפקטור bdf1 • הווריאנט ההיסטוני H2A.Z: מיפוי בשמרים, מנגנונים קובעי מיקום • מיפוי של מתילציה באדם, שימור אבולוציוני, תבניות מיוחדות בגני ה-Hox • דיון – שאלות פתוחות

3. The language of covalent histonemodificationsBrian D. Strahl & C. David AllisNature, January 2000 Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Virginia Health Science Center

4. דחיסת הדנ"א באאוקריוטים(תזכורת מביולוגיה מולקולרית...)

5. מבט אל תוך הנוקלאוזום

6. היסטונים – היכרות ראשונית • החלבונים היוצרים עם הדנ"א את היחידה הבסיסית של הנוקלאוזום נקראים היסטונים • ישנם ארבעה זוגות של חלבוני ליבה (histone core) – H2A, H2B, H3, H4 ועליהם נוסף H1 שכרוך על הדנ"א מבחוץ • אלו חלבונים שמורים היטב באאוקריוטים, משמר ועד לאדם • בעבר חשבו שהם מרכיבים מבניים סטטיים בלבד. כיום ברור שיש להם תפקיד מרכזי בבקרת תהליכים מבוססי דנ"א (שעתוק, רפליקציה, תיקון, שחלוף...) • הבקרה מתבצעת ע"י מודיפיקציות קוולנטיות על הקצוות ה-N' טרמינליים של ההיסטונים

7. דוגמא – קצה N' של ההיסטון H3 - אצטילציה - פוספורילציה - מתילציה ישנן מודיפיקציות נוספות בקצוות (ADP ריבוז, יוביקויטינציה) יש מודיפיקציות גם בחלק הגלובולרי

8. הווריאנט ההיסטוני CNEP-A • באזורים מסויימים בכרומוזום קיימות גירסאות ייחודיות של חלק מההיסטונים, ויש להן כנראה תפקידים מיוחדים • דוגמא: באזור הצנטרומר ישנו וריאנט מיוחד של H3, CNEP-A • כמעט כל השיירים החיוביים הם ארגינין • הרבה שיירי S,T – סרין ותראונין => כנראה עובר זרחון לקראת חלוקה • מוטיב שחוזר 5 פעמים: S/T/G-P, ומשני צידיו RR

9. עיבוד של שיירים היסטוניים • משפחות חלבונים שאחראיות לכך: היסטון אצטילאזות (HATs), היסטון דה-אצטילאזות (HDACs), מתילאזות וכד' • חלבונים אלו פועלים לבד או כחלק מקומפלקס • לחלבונים שונים בכל משפחה יש ספציפיות לשיירים שונים, כנראה ע"י רצפי הכרה שונים (מחקרים שנעשו בשמרים – קריסטלוגרפיה של HATGCN5 וחברים). תופעה דומה מוכרת בקינאזות. • לצורך הסקירה, נתמקד בקצה ה-N' של ההיסטון H3

10. תפקידים של מספר מודיפיקציות:אצטילציה, מתילציה • אצטילציה קשורה לשעתוק, וכנראה גם להרכבת הכרומטין. [להיסטונים יש תבנית אצטילציה ראשונית שנמחקת לאחר ההרכבה. קומפלקס הרכבת הכרומטין בדרוזופילה, RCAF, ספציפי ל-H4 שמאוצטל בשיירי ליזין 5,12 ] • מתילציה מזוהה עם שעתוק (נפרט בהמשך). [סוגי מתילציה שונים – די מתיל, טרי מתיל. הבדלי מטען זניחים]

11. האם המודיפיקציות פועלות רק באופן כימי ישיר? גדיל דנ"א שלילי אצטילציה ושעתוק: אינטראקציות דנ"א - היסטונים אצטילציה מקטינה את המטען החיובי של ההיסטונים. הקשר בין הדנ"א להיסטונים מתרופף, והדנ"א פתוח יותר לשעתוק. ליבה היסטונית חיובית

12. תפקידים של מספר מודיפיקציות:פוספורילציה • דחיסת הכרומוזום במהלך מיטוזה • דיכוי כרומוזום X (יחד עם אצטילציה של ליזין 16 ב-H4) • תיקון נזקים בדנ"א – סימון האזור הפגוע • מעורבות בשעתוק: העלאת ביטוי immediate early genes • מוטציות בקינאז Rsk2, שמזרחן שיירי סרין ב-H3, מתבטאות באובדן פקטור גדילה (תסמונת Coffin-Lowry באדם). • תפקידים מנוגדים – שעתוק לעומת דחיסת כרומטין !

13. פעילות משותפת של מספר מודיפיקציות • צירוף אצטילציות / פוספורילציות לפתיחה של הכרומטין • צירוף כזה (זרחון H3S10 עם אצטילציה של H3K14) פועל להגברה מהירה של ביטוי immediate early genes בתגובה לגירויים • בניגוד לכך, זרחון של שיירי סרין 10 ו-28 ב-H3 ממלא תפקיד דווקאבדחיסהשל הכרומטין לקראת חלוקה תאית (מיוזה / מיטוזה) כיצד יתכן שלאותה מודיפיקציה יהיו שתי השפעות הפוכות זו מזו??

14. השערת 'הקוד ההיסטוני'The Histone code hypothesis • Strahl & Allis משערים שהמודיפיקציות ההיסטוניות פועלות יחד, כסוג של 'קוד' • תבניות עיבוד שונות יגייסו אנזימים שונים • אותה 'אות' (מודיפיקציה ספציפית) יכולה להופיע ב'מילים' שונות (תבניות עיבוד), שמשפיעות בדרכים שונות ואפילו מנוגדות

15. הקוד ההיסטוני – המחשת ההבדלים } }

16. השערת הקוד ההיסטוני – מבט סכמאטי א) פעילות משותפת של HATs, HMTs, קינאזות עם רצפטורים תאיים כמו Act, לעיבוד היסטונים ב) קומפלקסים פותחי-כרומטין נקשרים להיסטונים המעובדים, למשל ע"י ברומו-דומיין ג) נגרם שעתוק (אולי בסיוע חלבונים נוספים) משערים שמנגנון דומה פועל גם להפך – למשל בדחיסה לקראת חלוקה ידוע ברובו משוער ברובו

17. מוטיבציה וכיוונים להמשך • כעת ברור, שתהליכים רבים בתא מבוקרים ע"י עיבוד היסטונים • משערים שעיבוד ההיסטונים גם קובע סדר של תהליכים: נראה שקומפלקסים מסויימים משאירים מודיפיקציות, שגוררות הגעה של הקומפלקס 'הבא בתור' • נדרש מאמץ לזיהוי התפקידים השונים של כל מודיפיקציה, לבד או כחלק מתבנית • נדרש מאמץ גם להבנת המנגנונים האנזימטיים האחראים לעיבוד ההיסטונים • מה ההשפעה במקרים של תפקוד לא-תקין? (מחלות, פנוטיפים מוטנטיים?)

18. Mapping Global Histone Acetylation Patterns to Gene Expression Kurdistani et al. Cell , June 2004 (UCLA; Princeton University)

19. מבוא • מחקר בשמר S.cerevisiae, המנתח פרופיל אצטילציה של 11 שיירי ליזין בארבעת חלבוני הליבה ההיסטונית • המטרה – בדיקת ההתאמה בין מצב האצטילציה של עמדות שונות, ובין אצטילציה באזורים גנומיים שונים לביטוי גנים • השיטה – צירוף של chIP, microarray, כלים הסתברותיים וחישוביים

20. איסוף הנתונים • בידוד דנ"א מהזן YDS2 (wt) • הדבקה ע"י נוגדנים עם ספציפיות לעמדה מסויימת • הפרדה ושכפול ע"י PCR • היברידיזציה ל-microarray שמכיל כ-6700 מקטעים חופפים של IGRs, ו-6200 של ORFs • לקחו את הממוצע של 2-4 ניסויים

21. השוואת מצבי האצטילציה בין שיירים שונים • בטבלאות המנורמלות ניתן לראות התאמה יחסית של רמת האצטילציה בשני שיירי ליזין • לא נעשתה השוואה בין רמות האצטילציה ב-IGR לעומת ORF, רק השוואות יחסיות בתוך כל אחד מהסוגים • ניתן לראות הבדלים בין רמות התיאום בין אותם שיירים ב-ORF לעומת IGR (בגרף התחתון)

22. בעיות ומגבלות טכניות • אין השוואה בין IGRs ל-ORFs • נעשה שימוש במקטעים ארוכים של 1 kb. ייתכן כי בדיקה ברזולוציה גבוהה יותר תראה שוני ברמות האצטילציה של נוקלאוזומים בודדים • נירמול בעייתי

23. התאמה בין אצטילציה לשעתוק נבדקה ההתאמה בין רמת האצטילציה של עמדות בודדות לבין רמת השעתוק של הגן הקרוב ביותר downstream נמצא כי יש עמדות מסויימות עם התאמה חזקה, חיובית או שלילית

24. מקבצים לפי דמיון בתבנית האצטילציה • נעשה שימוש באלגוריתם הקיבוץ K-means , כדי לזהות קבוצות של לפחות 20 IGRs עם התאמה מעל 0.7 בין כל שנים בקבוצה • נמצאו גם מקבצים דומים של ORFs(בגרף נפרד)

25. דוגמאות להבדלים בין קבוצות שונות האם יש למקבצים אלו משמעות ביולוגית משותפת (רמת שעתוק, תפקידים, מוטיבים)?

26. האם יש למקבצים אלו משמעות ביולוגית משותפת? נבדקו מספר פרמטרים: • ביטוי משותף של הגנים (co-expression) • פונקציונליות משותפת: מעורבות באותם תהליכים ביולוגיים • מיקום תוך-תאי • רצפי בקרה משותפים • קשירת פקטורי שעתוק

27. ביטוי משותף של גנים • נבדקה רמת הביטוי של הגנים המתאימים ב-255 תנאים שונים • נמצאו מקבצים רבים של IGRs / ORFs עם רמות ביטוי דומות של רוב הגנים דוגמא: ביטוי ממוצע של כל מקבץ, במהלך גידול אקספוננציאלי ברבע מהמקבצים נמצא שיעור ביטוי בהסתברות נמוכה מ-0.01 לאקראיות

28. דוגמא של מקבצים מתואמים שלילית תבניות האצטילציה ביטוי במגוון תנאים

29. פונקציונליות משותפת • נעשתה חלוקה לפי מקבצים של annotations מכמה מסדי נתונים • נמצא כי עבור 12 מתוך 53 מקבצי IGR , ו-13 מתוך 68 מקבצי ORF , הגנים מעורבים באופן משמעותי באותם תהליכים ביולוגיים • תהליכים אלו כוללים סינתזת חלבונים, תקשורת אנדופלזמית ומיקום במעטפת הגרעין, מטאבוליזם של קרבוהידראט, ומיקום במיטוכונדריה.

30. מוטיבים רגולטוריים משותפים חיפוש מוטיבים באזורי ה-IGR ובאזורים שלפני ה-ORF, ע"י AlignACE, הביא למציאת מוטיבים רבים שעמדו בקריטריון P < 0.0001 מוטיב 3 דומה מאד לאתר הקשירה של Rap1, שנמצא לפני גנים רבים המקודדים לחלבונים ריבוזומליים, השייכים למקבץ 1. מקבץ 6 עשיר ב-STRE, stress-response element, מה שתואם לאקטיבציה של מקבץ זה בתגובה למגוון של פגיעות סביבתיות. (זה לא המוטיב שמופיע באיור)

31. פקטורי שעתוק משותפים הניתוח נעשה לפי מידע שפורסם על נתוני הקשירה לדנ"א של 25 פקטורי שעתוק (Lee et al. , 2002)

32. הקשר בין Bdf1 לאצטילציה • הפקטור bdf1 נקשר להיסטונים מאוצטלים in vitro • בכדי לבדוק את המצב in vivo, בוצע מיפוי של קשירתו לגנום השמר, ואחר כך נעשתה השוואה לרמת האצטילציה באזורי הקשירה • נמצאה התאמה חיובית לרוב העמדות, אך לא לכולן. • ניגוד בולט ב - H4K16

33. עמדה H4K16 מאוצטלת פוגעת בקשירת Bdf1 כדי לאמת השערה זו, נבחרו ארבעה גנים קושרי-bdf1, ונבדקה רמת הקשירה עבור מוטציות שונות בהיסטונים { K->R: מדמה מצב לא מאוצטל K->Q: מדמה מצב מאוצטל

34. סיכום ביניים וכיוונים להמשך • קיים תיאום חיובי / שלילי של רמת האצטילציה בין שיירי ליזין שונים • גנים שמקובצים לפי תבניות אצטילציה מראים התנהגות דומה (רמת ביטוי, תפקיד, רצפי ופקטורי בקרה) • הפקטור Bdf1 ספציפי in vivo להיסטונים מאוצטלים, אך במספר עמדות כגון H4K16, מתואם דווקא עם דה-אצטילציה • נרצה לדעת על תיאום של אצטילציה עם עוד מודיפיקציות, ועם תהליכים ביולוגיים נוספים

35. Histone Variant H2A.Z Mark the 5Ends of Both Active and Inactive Genes in EuchromatinRaisner et al. , Cell, January 2005 Department of Biochemistry and Biophysics, University of California Bauer Center for Genomics Research, Harvard University

36. רקע • הווריאנט ההיסטוני H2A.Z נמצא משני הצדדים של הטרוכרומטין מושתק, בכדי למנוע את התפשטותו לגנים פעילים • לרוב, מופיעים כשני נוקלאוזומים משני צידיו של אזור חסר-נוקלאוזומים (Nucleosome Free Region ) בו נמצא אתר תחילת השעתוק (TSS) • במחקר זה נבדקה התפוצה של H2A.Z על פני כרומוזום 3 בשמר, ע"י שימוש בשיטת ה-chIP

37. התפלגות H2A.Z על פני כרומוזום 3 • כל 'מקל' מייצג ערך עבור QPCR של מקטע בודד באורך 300 bp • המקטעים מפוזרים במרווחים שוים של 1000 bp בין קצה 5' למשנהו על פני הכרומוזום

38. התאמה חיובית להימצאות קצה 5' קרוב של גן גרף בפאזה לוגריתמית המשווה את השכיחות של H2A.Z למרחק בין המקטע הנבדק לקודון ה start הקרוב. מקדם המתאם חיובי (0.2662) יש לציין שלא נצפתה התאמה ניכרת בין קרבה לקצוות 3', לרמת השעתוק של הגן הסמוך, או לאתרים גנומיים אחרים (כגון Ori) H2A.Z Enrichment

39. בדיקה ממוקדת של אזור אינטרגני כיסוי רצף של 4.2 kb ע"י מקטעים של 200 bp כל אחד, מראה הבדלים משמעותיים בשכיחות H2A.Z בין האזור האינטרגני לבין האזורים המקודדים שלפניו ואחריו

40. דוגמא מורכבת יותר... • בכיסוי אזור של 11 kb, נצפו שיאים של שכיחות לפני / מעל קצה 5' של כל גן • באזור האינטרגני 5'-5' נצפו שני שיאים בהתאמה • בשני אזורי ה 3'-3' לא נצפו שיאים של שכיחות (תומך בהשערת ההעדפה של קצה 5' דווקא)

41. אנליזה ממוקדת עוד יותר • השלב הבא - מיפוי כל כרומוזום 3 ברזולוציה של 20 bp • כאן מוצגות התוצאות עבור האזורים מהשקפים הקודמים • כל שורה מייצגת ניסוי היברידיזציה נפרד – בסה"כ 5 • בתמונה העליונה ניתן להבחין בשני נוקלאוזומים עוקבים עם H2A.Z לפני חלק מהגנים

42. לאלו גנים יש H2A.Z בקצה 5'? • H2A.Z נמצא בקצה 5' של כמעט כל הגנים באאו-כרומטין, פרט לגני הזוויג המושתקים HMLα, גנים הסמוכים לטלומרים, ו-ORFs שצויינו בעבר כ'מפוקפקים' • ישנם שבעה גנים חריגים בלבד

43. NFR – Nucleic Free Region • לפני גנים פעילים בשמר מצויים אזורים של כ-200 bp ללא נוקלאוזומים, שמכילים את הפרומוטור • אזורים אלו הם AT-rich, ונוחים לפתיחה לצורך שעתוק (Yuan Et Al. , 2002)

44. H2A.Z ביחס לאזורי ה-NFR • יישרו את כל הגנים שנבדקו לפי מרכז ה-NFR שלהם, וביצעו clustering לפי תבנית השכיחות של H2A.Z ברצף upstream /downstream (שורה – פרומוטור וסביבתו, עמודה – עוצמת הווריאנט ב-20 bp) • כשני שליש מהגנים הראו שני נוקלאוזומים עם H2A.Z, שתוחמים את אזור ה-NFR

45. בדיקת ההתאמה בין רמות H2A.Z ושעתוק • הבדיקה התמקדה רק בגנים עם H2A.Z משני צידי ה-NFR • נבדקה ההתאמה בין ערך ה-enrichment בנוקלאוזום 3', 5' לאזור ה-NFR לבין רמת השעתוק של הגן (אדום) או מידת הקשירה של רנ"א פולימראז 2 אליו (כחול) • מקדמי המתאם קרובים מאוד לאקראיות (סדר גודל של 10^-3)

46. בדיקה ממוקדת בגנים לא-פעילים בדיקת שכיחות הווריאנט H2A.Z בגנים שאינם פעילים בתאים הפלואידיים (נבדקו גנים עם אזורי 5'-5' ביניהם) אותם 'פיקים' נצפו גם כאן, כמו בגנים פעילים

47. השוואת אצטילציה ו-H2A.Z בגן Aga2 • גן זה פעיל בזוויג a של השמר, ולא בזוויג α • נמצאה ירידה לחצי של מידת שכיחות H2A.Z בקצה 5' שלו • ירידה מקבילה בכמות ובמיקום (פחות או יותר) נמצאה גם באצטילציה של ההיסטון H4

48. בדיקה רחבה יותר של יחסי אצטילציה – H2A.Z פגיעה ב-HATs ספציפיים ל-H3,H4 הביאה לצניחה ברמת H2A.Z השפעה דומה נגרמה ע"י התמרת שיירים בקצוות של H3,H4 מליזין לארגינין לשיירי ליזין שונים יש השפעה שונה

49. בקרה ע"י Bdf1, Bdf2 - הפקטור bdf1 מהווה רכיב של הקומפלקס Swr1, האחראי להרכבת H2A.Z - השתקת bdf1 לא הביאה לשינוי משמעותי - בתוספת הפחתת ביטוי פקטור דומה, bdf2, נגרמה ירידה משמעותית לא ניתן היה להשתיק את שני הפקטורים, כי זהו פגם לטאלי. הפחתת הביטוי נגרמה ע"י החלפת ה-3’UTR, שהורידה את יציבות ה-mRNA (שולדינר ושות', 2005)

50. בעיה • ראינו במחקר קודם שרמה גבוהה של אצטילציה (ושל קשירת bdf1 לדנ"א) מזוהה עם רמת שעתוק גבוהה • כיצד יתכן שרמת הווריאנט H2A.Z מתואמת עם אצטילציה ופקטורי bdf, אך לא מתואמת כלל עם רמת השעתוק? • במאמר זה הבעיה נשארה פתוחה