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Le clonage

Le clonage. Les enzymes de restriction. X-gal: sélection bleu-blanc. La production d’une molécule recombinante. La production des molécules recombinantes-suite. -ligation avec l’ADN coupé avec un seul enzyme peut donner très peu de recombinantes -le rapport plasmide/insert est capital

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Presentation Transcript

  1. Le clonage

  2. Les enzymes de restriction

  3. X-gal: sélection bleu-blanc

  4. La production d’une molécule recombinante

  5. La production des molécules recombinantes-suite • -ligation avec l’ADN coupé avec un seul enzymepeut donner très peu de recombinantes • -le rapport plasmide/insert est capital • -traitement avec une phosphataseplus de recombinantes • -couper les molécules d’ADN avec 2 enzymesplus de recombinantes • -la température de la ligation: 20°C est mieux que 37°C • -extrémités franches-ligation plus difficile: réduit la température et augmente le temp de ligation

  6. Digestion avec 2 enzymes • 5’-----AAGCTT------------GAATTC---------3’ • 3’-----TTCGAA------------CTTAAG---------5’ • Plasmide avec une site HindIII et une site EcoR1 • Digestion avec les deux enzymes…… • 5’-----A AATTC--------3’ • 3’-----TTCGA G--------5’ • Une ligase ne peut pas mettre ces deux extrémités ensemble manque de compatibilité des nucléotides

  7. La transformation des bactéries-phase exponentiel-en présence de Ca++ à 4°C-choque thermique

  8. Gel d’agarose

  9. TP de clonage • Premier jour • -digestion de l’ADN de la bactériophage lambda et l’ADN de pBS avec des enzymes Hind III et Eco R1 • -inactivation des enzymes de restriction à 70°C • -ligation des produits de la digestion • -électrophorèse des produits de la digestion sur gel d’agarose • -transformation des bactéries compétentes • -étalage des bactéries sur les boîtes de petri amp/x-gal • Deuxième jour • -préparation des plasmides recombinantes • -digestion de l’ADN des plasmides • -électrophorèse des produits de la digestion • -identification des fragments de l’ADN de la phage lambda clonés dans le plasmide

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