第四节 酶活性浓度的测定技术 一、概 述 1 ．量气法： 此法很少采用。 2 ．分光光度法：

1. 第四节 酶活性浓度的测定技术 一、概 述 1．量气法： 　 此法很少采用。 2．分光光度法： 其最大优点在于扩大了测定范围，波长范围更宽。结合各种工具酶的偶联反应，如应用NAD(P)H和NAD(P)+吸收光谱差异建立的测定各种脱氢酶活性浓度的方法，使分光光度法得到了进一步发展，几乎可应用于各种血清酶活性的测定。随着各种自动生物化学仪和配套用试剂盒的普及应用，这一方法在临床酶学测定中起着十分重要的作用。

2. 3．荧光法和放射性核素法: 对于一些酶浓度很低的标本，可考虑改用灵敏度较高的荧光法或放射性核素法。荧光法取决于酶促反应生成荧光物质的速率，此速率与酶浓度成正比，并通过荧光光度计进行测定，根据荧光强弱的变化换算出酶的活性。例如，还原型的NAD(P)H有强烈的荧光，故所有以NAD(P)+为辅酶的氧化还原酶类均可用荧光法进行测定。核素法因有污染且操作烦杂，目前应用较少。 4．其他方法:

3. 二、酶活性浓度的测定 测定酶的催化活性浓度是临床酶学分析最为常用的方法，具有迅速、灵敏、成本低等特点。可根据酶促反应进程曲线，采用合理的方法进行酶活性浓度的测定。

4. (一) 酶促反应进程

6. (二) 酶活性浓度测定方法 酶活性浓度测定就是要使酶促反应的初速度(v) 达到最大速度Vmax，即在过量底物存在下的零级反应期的速度，此时反应速度与酶浓度 [E]之间有线性关系。如按反应时间将酶活性浓度测定方法进行分类，可分为定时法(fixed time assay)和连续监测法(continuous monitoring assay)两大类。

7. 1．定时法 这是早期测定酶活性浓度的方法。 大多是使酶作用一段时间，然后加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止酶促反应，测定这段时间内底物的减少量或产物的生成量，计算酶促反应平均速度。这类方法有多种命名，如“取样法”、“终点法”或“两点法”。

8. 用定时法测定酶活性浓度，必须保证酶和底物在所选定的温度下作用时间要很精确，否则会引起较大误差。这种方法的优点是比较简单，因测定时酶促反应已被终止，故比色计或分光光度计无需保温设备，显色剂的选择也可不考虑对酶活性的影响。缺点是无法知道在整个酶促反应进程中是否都是零级反应。用定时法测定酶活性浓度，必须保证酶和底物在所选定的温度下作用时间要很精确，否则会引起较大误差。这种方法的优点是比较简单，因测定时酶促反应已被终止，故比色计或分光光度计无需保温设备，显色剂的选择也可不考虑对酶活性的影响。缺点是无法知道在整个酶促反应进程中是否都是零级反应。

9. 2．连续监测法 连续测定酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间变化的多点数据，求出酶反应初速度，间接计算酶活性浓度的方法称为连续监测法。

10. 2．连续监测法 连续测定酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间变化的多点数据，求出酶反应初速度，间接计算酶活性浓度的方法称为连续监测法。与定时法不同的是，这类方法勿需停止酶促反应，不需添加其他呈色试剂，就可测定反应物的变化，很容易观察到反应的整个过程。

11. 连续监测法 这类测定方法简单，优点是可将多点的测定结果连接成线，很容易找到成直线的区段，可以观察到是否偏离零级反应，因而可选择线性反应期来计算酶活性，不需终止反应。通常截取反应开始后较短的时间，就能近似地建立这种反应量与反应时间的线性关系，不过这种时间范围因酶种类和反应条件而异，必须用实验方法进行确定。

12. 连续监测法测定结果常较定时法高，且因在酶促反应初始阶段底物最充裕，而产物的抑制作用、可逆反应、酶变性等均很小，因而测定结果也较取样法准确。

13. 3．平衡法 通过测定酶促反应开始至反应达到平衡时产物或底物浓度的总变化量来求出酶活性浓度的方法，称为终点法。与定时法不同的是，平衡法是在酶促反应平衡期([S]或[P]不变)任何一点进行测定，无需终止反应。目前此法已少使用。

14. 三、连续监测法测定酶活性浓度 随着科学技术的不断进步与发展，各种自动生物化学分析仪的广泛使用，连续监测法已逐步取代定时法而成为临床实验室测定酶活性浓度最常用的方法。 (一)连续监测法的种类 1．直接法 2. 间接法

15. 1．直接法 这类方法是在不终止酶促反应条件下，直接通过测定反应体系中底物或产物理化特性的变化如吸光度、荧光、旋光性、pH、电导率、粘度等，从而计算出酶活性浓度。其中以分光光度法应用最为广泛，也是方法学上最成熟的一种。

16. 利用NAD(P)H在340nm处的吸光度的变化测定各种脱氢酶的方法是应用最广的一类方法。NAD(P)H在260nm波长和340nm波长处有吸收峰，而氧化型NAD+／NADP+只在260nm波长处有吸收峰，这是因为分子中有腺嘌呤的缘故。340nm波长处吸光度的变化可以反映反应体系中NAD(P)H量的增减。还可利用一类人工合成的所谓“色素原”底物，其本身为无色或微黄色，酶作用后生成有色化合物，如目前应用硝基苯酚和硝基苯胺的衍生物进行水解酶和一些还原酶的测定。利用NAD(P)H在340nm处的吸光度的变化测定各种脱氢酶的方法是应用最广的一类方法。NAD(P)H在260nm波长和340nm波长处有吸收峰，而氧化型NAD+／NADP+只在260nm波长处有吸收峰，这是因为分子中有腺嘌呤的缘故。340nm波长处吸光度的变化可以反映反应体系中NAD(P)H量的增减。还可利用一类人工合成的所谓“色素原”底物，其本身为无色或微黄色，酶作用后生成有色化合物，如目前应用硝基苯酚和硝基苯胺的衍生物进行水解酶和一些还原酶的测定。

17. 2. 间接法 直接法虽然简单，但只有底物与产物之间，在理化性质等方面有显著差异时，才能使用直接法。故至今也只有很少一部分酶能用直接法进行测定。目前可采用两类间接法进行酶学测定。

18. 一类方法是在原来反应体系中加入一些试剂，这些试剂只和酶反应物迅速作用，产生可被仪器检出的物质变化，但同时又不和酶作用也不影响酶活性。典型的例子是血清ChE的丁酰硫代胆碱测定法。一类方法是在原来反应体系中加入一些试剂，这些试剂只和酶反应物迅速作用，产生可被仪器检出的物质变化，但同时又不和酶作用也不影响酶活性。典型的例子是血清ChE的丁酰硫代胆碱测定法。 另一类是目前应用最多，最为广泛的酶偶联法，即在原反应体系中加入另一些酶试剂，所进行的酶促反应和被测酶反应偶联起来。

19. (二)酶偶联反应 最简单的酶偶联反应(单底物反应且只有一个工具酶)模式为： 被测定酶(Ex)催化的反应称为始发反应；产生被检测物质产物C(如NADH)的反应称为指 示反应，相应的偶联酶(第二个酶)酶称指示 酶(Ei)。

20. 如果一些酶促反应找不到合适的指示酶与其直接偶联，此时往往还可在始发反应和指示反应之间加入另一种酶，将二者连接起来，此反应称为辅助反应。模式为：如果一些酶促反应找不到合适的指示酶与其直接偶联，此时往往还可在始发反应和指示反应之间加入另一种酶，将二者连接起来，此反应称为辅助反应。模式为： 一般习惯将最后一个酶称指示酶Ei，其他外加的酶称为辅助酶(Ea)。个别情况还可能使用两种或以上的辅助酶。将这一连串酶促反应称为酶偶联体系。

21. 临床常规酶学分析所用的酶偶联法中，多以脱氢酶为指示酶。通过监测其反应物NADH或NADPH于340nm处吸光度的变化速率，可以很容易地监测指示酶反应。临床常规酶学分析所用的酶偶联法中，多以脱氢酶为指示酶。通过监测其反应物NADH或NADPH于340nm处吸光度的变化速率，可以很容易地监测指示酶反应。

22. 用酶偶联法测定酶活性浓度时，并不是一开始反应就全部反映了测定酶活性。这是因为在偶联反应中存在几个时相：一是预孵育期，反应一开始只存在底物 A，不存在指示酶的反应，在此时相中使存在于样品中的干扰物质充分进行反．应，将试剂中的NADH变为NAD+。二是延滞期，加入底物启动反应，在启动后的一段短时间内，产物 B开始出现并逐渐增加，处于较低水平，指示酶反应速度也较低，不能代表测定酶的反应速率Vx，这一时期称为延滞期。随着产物B增加到一定程度时，Ex和 Ei反应速率相同，达到了稳态期。此阶段 340nm波长处吸光度才会有明显的线性变化。最后由于底物消耗，反应速度又复减慢。

23. 设计或选择酶测定方法时，如用酶偶联法，延滞期越短越好，测定时间一定要避开此期。

24. 为了保证准确测定酶活性，酶偶联反应的反 应速率应超过或等于测定酶的反应速率，指示酶 反应必须是一级反应，即指示酶反应速率应和测 定酶的产物 B浓度成正比。只有当使用大量的指 示酶，以及指示酶的Km很小时，才能做到这一点。 一般说来酶偶联法中所用的指示酶 Km值都很小， 酶促反应最适pH应与工具酶的反应最适 pH 相接 近。当然在选用指示酶时还应从经济方面考虑选 用一些来源容易且价格便宜的酶制剂。

26. (三)干扰因素 临床测定酶活性浓度标本都是体液，其中除测定酶外，还存在着其他各种酶和其他物质，因此在实测反应中可能出现一些副反应或旁路反应，这些都会对测定反应产生干扰。

27. 1．其他酶和物质的干扰 反应体系各成分除可能引起测定酶反 应外，还有可能引起其他酶的反应而干扰 测定。例如酶偶联法测 ALT时，由于反应 体系中含有大量NADH和LD，可与血液标本 中所含丙酮酸反应，引起 340 nm波长处 吸光度下降，从而引起ALT活性测定误差。

28. 2．酶的污染 因试剂用酶多从动物组织或细菌中提取，易污染其他酶，如不设法除去将引起测定误差。如组织匀浆中往往含有NADH-细胞色素C还原酶，它将干扰各种还原酶的测定。使用的酶制剂(如工具酶)必须提纯。例如测AST时，被苹果酸脱氢酶所污染的AST不应超过相对量的5x10-5(0.005％)。

29. 3．非酶反应 有些底物不稳定，没有酶的作用就会自行反应。例如很多硝基酚的酯类衍生物在水溶液中不稳定，放置一段时间可自行水解释放出硝基酚。类似情况还可见于一些内部因素如pH变化而引起的空白对照的变化。又如测定ALD时，其底物醛类化合物可以和NAD+起非酶反应产生一种具有类似NADH的吸收光谱的衍生物，给测定带来困难。

30. 4．分析容器的污染 如分析容器或管道污染而混杂有其他一些物质，可能影响酶的活性。如微量重金属可使酶失活，残留的表面活性剂可能抑制酶活性。

31. 5．沉淀形成 使用分光光度法测定酶活性时，如有沉淀形成或组织匀浆中颗粒的下沉都会引起吸光度变化。常加入表面活性剂以防止颗粒从匀浆中析出。有些酶反应需镁离子作为辅因子，如反应液中含有多余磷酸根时将有沉淀出现。

32. 解决上述干扰问题的方法之一可通过试剂空白管检出并加以校正。即有时不仅要作标本对照管，还要作试剂空白管。另一个有效途径就是不用单一试剂而改用双试剂测定酶活性。解决上述干扰问题的方法之一可通过试剂空白管检出并加以校正。即有时不仅要作标本对照管，还要作试剂空白管。另一个有效途径就是不用单一试剂而改用双试剂测定酶活性。

33. 四、工 具 酶 通常把酶学分析中作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性浓度的酶称为工具酶。常使用酶偶联体系进行测定，指示酶和辅助酶作为反应系统中的试剂。

34. (一) 常用工具酶及其质量要求 常用工具酶多为氧化还原酶类，这是因为其产物最易被直接监测而成为指示酶。在一系列利用工具酶的反应中，主要限速因子应该是待测化合物和待测酶，工具酶和其辅助底物应过量。

35. (二)工具酶参与的指示反应 近年来，在临床生物化学检验中，许多项目的测定往往使用有工具酶的参与的类似的反应原理，即所谓共通(或通用)反应途径。

36. 最常用的有两类分光光度法： 一类是利用较高特异性的氧化酶产生过氧化氢(H2O2)，再加氧化发色剂比色； 一类是利用氧化-还原酶反应使其连接到NAD(P)—NAD(P)H的正／逆反应后，直接通过分光光度法或其他方法测定NAD(P)H的变化量。

37. 1．偶联H202的工具酶及其指示反应 临床化学测定中，可利用葡萄糖氧化酶、尿酸氧化酶等工具酶分别用于葡萄糖、尿酸的测定，可使相应底物被氧化生成H202。H202主要通过以氢(或电子)为受体的指示酶和以NAD(P)H为辅酶参与的两类指示反应进行检测。前者主要有两类工具酶参与反应：过氧化氢酶或称触酶(catalase)及过氧化物酶(peroxidase,POD)，两者均为含三价铁的指示酶。以指示酶POD最为常用，主要催化以下两种反应。

38. 一种是在POD的直接催化下，H202氧化芳香族胺色素原生成有色的色素，此类色素原供氢体有邻联甲苯胺(OT)、联苯胺(DAB)、邻联茴香胺(ODA)和3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)。其中只有TMB无致癌性，且其生色的灵敏度最高。一种是在POD的直接催化下，H202氧化芳香族胺色素原生成有色的色素，此类色素原供氢体有邻联甲苯胺(OT)、联苯胺(DAB)、邻联茴香胺(ODA)和3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)。其中只有TMB无致癌性，且其生色的灵敏度最高。

39. 2．NAD(P)+或NAD(P)H偶联的 脱氢酶及其指示反应 许多氧化还原反应，尤其是作为工具酶的脱氢酶如LD、GLD、G6PD等参与时，常将底物的氢原子去除后传递给NAD(P)+而形成NAD(P)H。LD主要以NAD+／NADH为辅酶，而GLD则不论来自肝或细菌，均可以NAD+／NADP+或其还原型为辅酶。因NAD(P)H在340nm有特征性光吸收，可借此用分光光度法进行检测。目前利用此类反应的测定项目至少有葡萄糖、尿素、β-羟丁酸、甘油三酯、甲醇、血氨、ALT、AST、LD、GLD、CK、ALD、G6PD和lCD等。

40. 为了简化操作过程，并使酶试剂得以方便或反复使用，已有许多研究将水溶性的酶通过吸附、包埋、载体共价结合或通过酶分子间共价交联等方法固定在支持物上，并保持其原有的活性，这样制备的酶称为固相酶(或固定酶)(immobilized enzyme)。近些年来，固相酶技术发展迅速，特别是固相酶膜的应用使临床生物化学检验进入了干化学的时代，一些测定变得更加方便、快速。酶电极、酶探针等也在不断研制开发中，相信此类技术将成为临床生物化学发展的一个新方向。

42. 五、血清酶活性浓度测定条件的优化 测定酶活性浓度方法所选择的测定条件应是酶促反应的“最适条件”，即指在所选择温度下能使酶促反应的催化活性达到最大所需的条件。

43. 最适条件主要与下述一些因素有关： (1)底物、辅因子、激活剂、缓冲液和变构剂种类和浓度； (2)指示酶和辅助酶的种类和浓度； (3)反应混合液的pH和离子强度； (4)其他可变因素，如已知抑制剂的去除。 在某些情况下，为了使最终测定系统达到最大的测定重复性，可考虑对最适条件进行适当修改。

44. (一)方法选择 应尽可能全部采用连续监测法，少用或不用定时法。尽量减少操作步骤，以避免过多的吸量和接触太多的容器表面而引起的误差。

45. (二)仪器和设备 应明确规定仪器和设备的各种性能规范，推荐使用性能符合要求或经检定合格的分光光度计、半自动或全自动生物化学分析仪及其他相应的配套设备。任何接触标本、试剂或反应混合物的表面都必须经化学清洗，去除干扰酶活性测定的一些物质，如极少量的酸、金属、去垢剂或其他复合物等。

46. (三) 试剂 化学试剂必须具有一定纯度，不含影响 反应速度的杂质。试验用水最好是纯水或双蒸水。如果水中存在酶的抑制剂，其浓度应低于最小抑制浓度。如所配制试剂需保存较长时间，则应使用无菌水。选用符合临床实验室要求的试剂，建议用液体双试剂。

47. (四)自动生物化学分析仪参数的设置 方法中应详细列出测定酶催化浓度的全部操作过程。可参考仪器及试剂给出的方法和参数进行设置。

48. 1．方法类型 定时法或连续监测法。反应方向分正向／向上／+(吸光度增加)或负向／向下/-(吸光度减低)。如ALT、AST测定选用负向反应。

49. 2．波长 选择酶促反应体系吸光度最大的波长，如用双波长应写明主波长／次波长。因双波长能有效消除干扰的影响，故常被采用。

50. 3．样品量与试剂量 应考虑测定的灵敏度和测定上限选用合适的样品与试剂体积比。一般推荐样品与试剂体积比为1：10。如样品所占比例过小会降低灵敏度，样品量过大，则测定线性下降，样品要稀释后复检的机会增多。