第四章基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达

第四章基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达

4.1 基因的表达系统与表达策略一、基因的表达系统 • 1.基因的表达基因的表达，简言之就是有目的的合成目的基因产物。它包括转录、翻译、加工等过程。首先是使目的基因编码序列在RNA聚合酶催化下转录成mRNA，然后mRNA与核糖体结合，由tRNA将氨基酸引入，按mRNA的遗传信息翻译为多肽

2.载体应具有的几种元件 • 1)允许其在宿主体内自主复制的序列。 • 2）选择标记的编码序列。 • 3）控制转录的启动子。 • 4）多克隆位点。 • 5）转录调控序列。

二、根据表达蛋白用途选择基因的表达策略 • 1.生物化学和分子生物学研究 • 具体表达策略：1）表达出带有特异性的 • 蛋白酶位点的融合蛋白。 • 2）直接表达天然蛋白。 • 2.表达蛋白质用作抗原

三、结构研究 （蛋白质必须以可溶性形式产生，纯化时不用变性/复性步骤。）

4.2 基因在大肠杆菌中的高效表达 • 一、基于T7噬菌体RNA聚合酶/启动子的大肠杆菌表达系统 • 1.基本原理 • 1）T7噬菌体RNA聚合酶合成RNA速度高于大肠杆菌的5倍。 • 2）T7噬菌体RNA聚合酶只识别自己的启动序列，不启动大肠杆菌DNA任何序列的转录 • 3）T7噬菌体RNA聚合酶对抑制大肠杆菌RNA聚合酶的抗生素有抗性。 • 4）在适宜的条件下，T7噬菌体RNA聚合酶/启动子表达系统的基因产物可以占细胞总蛋白的 25%以上。

2.表达载体与受体菌 1) 载体种类: PET15,PET16,PET28,PET30,PET42等。 2）受体菌株种类： BL21,BL21 PLYsS.

3.实验方法 1）目的基因片段与用同样的限制性内切核酸酶消化的载体PET28a大片段连接，转化大肠杆菌BL21(DE3)株。 2）转化物涂布于LB/卡那霉素/IPTG平板， 37℃温育培养过夜。 3）挑选几个单菌落于LB/卡那霉素/IPTG培养基中，37℃培养至OD600约0.6-0.8。 4）通过小量制备方法获得质粒DNA. 5）选择正确的克隆

4.影响目的基因表达的因素 1）mRNA中是否有不为其二级结构封阻的RBS。 2）确定转录终止子的存在与否 3）检查克隆基因序列的密码子是否为大肠杆菌不常用者。

二、蛋白质的融合表达 • 1.基本原理融合表达一般是将克隆化基因引入某表达载体编码的高表达蛋白（担体蛋白）氨基酸末端的一段序列（担体序列）的 3′末端。 • 2.谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白的表达及纯化 • 3.硫氧还蛋白融合蛋白的表达与纯化

三、蛋白质的分泌型表达 四、蛋白质的包涵体形式表达与蛋白质复性

要减少包涵体的形成 1）降低重组菌的生长温度。 2）添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂。 3）供给丰富的培养基，创造最佳培养条件。

五、重组大肠杆菌的高密度培养

4.3 基因在酵母中的高效表达一、酵母表达系统概述二、甲醇酵母表达系统

1.甲醇酵母的生物学 2.表达载体和受菌体 3.甲醇酵母的转化与目的基因的整合 4.甲醇酵母表达系统的有点 1）具有强有力的乙醇氧化酶基因启动子，可严格调控目的蛋白的表达; 2) 可对表达的蛋白进行翻译后的加工和修饰，从而使表达出的蛋白具有生物活性； 3）营养要求低，生长快，培养基廉价，便于工业化生产 4）可高密度发酵培养； 5）表达量高； 6）表达的蛋白既可存在于细胞内，也可分泌之细胞外。 7）糖基化程度低。

5.影响目的基因在甲醇酵母中表达的因素 1）目的基因的特征可以通过调整高A+T含量区的核苷酸组成来避免提前终止的发生。 2）表达框的染色体整合位点与基因拷贝数 3）宿主菌的甲醇利用表型 4）分泌信号 5）产物稳定性 6）翻译后修饰

三、组织纤溶酶原激活剂在甲醇酵母中的表达 1.t-PA的结构与功能 • 1）功能：清楚血管内不溶性纤维蛋白，保证血液循环畅通。 • 2）结构：A.重连和轻链 B.指型区 C.表皮生长因子区 D.三角区 E.糖链 2. t-PA基于的获得与克隆 3.酵母转化、筛选与表达 4.蛋白质纯化 5.活性鉴定

第四章 基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达