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Dispersi ón de luz (light scattering ). Matías Möller Fisicoquímica Biológica. Dispersión de luz. Por qué el cielo es azul? Cómo se ve el cielo de la luna?. Dispersión de luz. John William Strutt Lord Rayleigh. Dispersión de luz.
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Dispersión de luz(light scattering) Matías Möller Fisicoquímica Biológica
Dispersión de luz • Por qué el cielo es azul? • Cómo se ve el cielo de la luna?
Dispersión de luz John William Strutt Lord Rayleigh
Dispersión de luz El fotón incidente induce un dipolo oscilante en la nube electrónica. Al cambiar el dipolo, la energía se irradia-dispersa en todas direcciones.
Dispersión de luz por proteínas • Intensidad de luz dispersada es proporcional a la masa molecular y concentración • Sensible a la presencia de pequeñas cantidades de agregados • Polidispersity (homogeneidad) control de calidad, cristalización de proteínas
Dispersión de luz por proteínas Se puede analizar de diferentes maneras: • Intensidad promedio (Estática) (SLS, static light scattering) • Fluctuaciones en la intensidad (Dinámica) (DLS, dynamic light scattering)
Dispersión de luz estática • Medida de masas moleculares Intensidad promedio de dispersión es función de la masa molecular y el 2do coeficiente virial K = constanteóptica MM = masa molecular A2 = 2docoeficientevirial C = Concentración (g/L) Rq = relación de Rayleigh (términoqueincluye la intensidad)
Dispersión de luz estática Relación de Rayleigh Constante Factor de forma, = 1 si r < 60 nm (pararm < l/10)
Dispersión de luz estática • La intensidad de luzdispersadaque produce unamacromolécula es proporcional al producto de la masa molecular promedio y la concentración de la macromolécula (I α MM.C) • Si no hay dependencia entre la intensidad de dispersión y el ángulo de medida, se puede determinar MM con medidas en un solo ángulo • Un gráfico de Debye permite la determinación de: • MM absoluta • 2do coefcientevirial (A2)
Dispersión de luz estática • Gráficos de Debye: Preparar un número de concentraciones de la proteína en un buffer apropiado
Dispersión de luz estática Ecuación de Rayleigh Unagráfica de KC/Rqvs C deberíadarunalinea recta cuyointercepto a cero concentraciónserá 1/MW y el gradiente A2
Dispersión de luz estática 2docoeficientevirial • Propiedadtermodinámica que describe la fuerza de interacción entre la molécula y el solvente • Si A2> 0, lasmoléculastienden a permanecer en solución (la proteínaprefiere el buffer) • Si A2 = 0 la fuerza de la interacciónproteína-solventeesequivalente a la fuerza de la interacciónproteína-proteína (el solvente se llama solvente theta) • Si A2 < 0, la proteínatiende a precipitar o agregar
Dispersión de luz estática Masa molecular de proteínas
Dispersión de luz estática Medidas • En batch/cubeta • En líneacombinado con un paso de fraccionamiento, principalmenteCromatografía de exclusión molecular
Dispersión de luz estática La masa molecular medida en experimentos de dispersión son MM promediadapor el peso (fracción en g) Para un sistema simple de dos componentes con proteínamonomérica y agregados:
Dispersión de luz estática Para determinar MM individuales: • Fraccionar la muestra • Combinarmedidas de dispersión con un paso de fraccionamiento SEC / MALS
Dispersión de luz estática (índice de refracción)
Dispersión de luz estática (índice de refracción)
Dispersión de luz estática • Señal de dispersión Rqα MM C • Debido a alta MM, los agregados dispersan fuertemente • Variación angular en la Intensidad de luz dispersada se relaciona con el tamaño de la molécula • La luz dispersada por agregados muestra dependencia angular, mientras que la luz dispersa por monómeros y dímeros no.
Dispersión de luz estática (índice de refracción)
Dispersión de luz estática • Pros Determinacion de MM rapida y exacta (promedio) de macromoleculas en solución Combinando SEC-MALS se puede determinar MM con una precision ± 5% Dependencia angular de señal de LS detecta agregados SEC-MALS permite detectar y cuantificar poblaciones de proteinas según sus MM Puede determinar estado oligomerico de polipeptidos modificados (prot-acidosnucleicos, glicosilados, etc. • Contras • Mide MM promedio, necesita separación para distinguir estados oligoméricos Posible perdida de muestra durante filtración y fraccionamiento
Dispersión de luz Dinámica DLS Permite determinar el tamaño de moléculas y nanopartículas Mide las fluctuaciones en la intensidad de dispersión con el tiempo para determinar el coeficiente de difusión translacional (D), y luego el radio hidrodinámico La velocidad de fluctuaciones depende del tamaño de la partícula - molécula
Dispersión de luz Dinámica Fluctuaciones son resultado del movimiento browniano y puede correlacionarse con el coeficiente de difusión y el tamaño
Dispersión de luz Dinámica • La temperatura tiene que ser estable y exactamente determinada (regular la viscosidad y evitar la convección) • Las partículas más grandes se mueven más lentamente • A mayor temperatura, más rápido se mueven las moléculas • La velocidad del movimiento Browniano está definido por el coeficiente de difusión translacional (D)
Dispersión de luz Dinámica • Las fluctuaciones en la intensidad no son al azar, sino consecuencia del confinamiento de las partículas a sitios cercanos a la posición inicial en tiempos muy cortos
Dispersión de luz Dinámica Autocorrelación
Dispersión de luz Dinámica correlograma
Dispersión de luz Dinámica Pros • En cubeta, muy rápida detección de agregados y evaluación de la polidispersión de la muestra con un amplio rango dinámico • Adecuado para estudiar cinética de agregación • Detector disponible para placas, parara screening Contras • Mide radio hidrodinámico, es cual es afectado por la forma de la partícula • No puede distinguir entre cambios de forma o estado de oligomerización • Necesita fraccionamiento para resolver oligómeros presentes en una mezcla
Bibliografía • Protein sizing by light scattering, molecular weight and polydispersity, Malvern Instruments presentation, http://nanoparticles.org/pdf/nobbmann.pdf
