Pristupnik: Ivana Erceg Ivkošić, dr. med. Mentor: Prof. dr. sc. Dragan Primorac

1. ANALIZA UČINKA TRANSKRIPCIJSKIH ČIMBENIKA DLX5 I MSX2 NA RAZVOJ OSTEOBLASTA b-AKE TRANSGENIČNIH MIŠEVA Pristupnik: Ivana Erceg Ivkošić, dr. med. Mentor: Prof. dr. sc. Dragan Primorac JAVNA RASPRAVA O TEMI DOKTORSKE DISERTACIJE Split, studeni 2010.

2. KOST KORTIKALNA protektivna mehanička SPONGIOZNA metabolička

3. Transkripcijski čimbenici u razvoju kosti Msx2 Osterix Dlx5

4. Čimbenici razvoja osteoblasta Dlx5 Msx2

5. OBITELJ DLX GENA • visoko sačuvanu homeodomenu s "distal-less"genimaDM • šest Dlx gena u kralješnjaka • organizirani su u parove Dlx1-Dlx2, Dlx3-Dlx4 i Dlx5-Dlx6 • geni Dlx1, Dlx2 i DLX5 su izraženi u gornjoj čeljusti, škržnim lukovima, zubnim pupoljcima i mozgu • Dlx5 i Dlx6 izraženi u većini razvojnih elemenata koštanog sustava

6. TRANSKRIPCIJSKI ČIMBENIK DLX5 • kodiran od strane Dlx5 gena u ljudi, lociran na kromosomu 7 • u pilećim udovima Dlx5 prisutan je u razvijajućim hrskavičnim i skeletnim elementima • izražen je u stanicama koje postaju početna koštana osnova koja okružuje hrskavicu • potiče izraženost gena kolagen tipa I, COL1A1 • odgovoran za odlaganje koštanog matriksa i sazrijevanje osteoblasta u pilećem eksperimentalnom modelu

7. MUTACIJE DLX5 • mutacije Dlx5 i Dlx6 gena u ljudi dovode se u svezu s razvojem autosomno dominantne bolesti “split-hand/split-foot malformations” • inaktivacija gena Dlx5 u miševa uzrokuje kraniofacijalne koštane defekte, a kortikalna kost u dijafizi dugih kostiju je lošije organizirana • u genetički modificiranih miševa s neaktivnim Dlx5 i Dlx6 genima izraženiji su koštani defekti udova i kraniofacijalne anomalije nego u miševa kojima je inaktiviran samo Dlx5, te perinatalno umiru

8. TRANSKRIPCIJSKI ČIMBENIK MSX2 • pripada obitelji Msh transkripcijskih čimbenika, a uključuje Msx1, 2 i 3 transkripcijski čimbenik • Msx3 se nalazi u stanicama središnjeg živčanog sustava • Msx1 i 2 su izraženi u različitim tkivima u raznim stadijama razvoja organizma • Msx2 pokazuje najjaču izraženost u području šavova lubanjskih kostiju • Msx2 inhibira izraženost gena kolagen tip I u transfeciranim stanicama osteosarkoma štakora ROS17/2,8 stanicama, te osteokalcina u MC3T3E1 stanicama

9. TRANSKRIPCIJSKI ČIMBENIK MSX2 • mutacija humanog gena Msx2 uzrokuje kraniosinostozu • prekomjerna izraženost Msx2 u transgeničnih miševa uzrokuje također prerano spajanje lubanjskih šavova • u genetički modificiranih miševa s neaktivnim Msx2 uočene su anomalije razvoja kostiju, razvoja malog mozga, zubiju i dlačnih folikula • veže se za Dlx5 i stvara funkcionalni antagonizam

10. replikacijsko kompetentni ptičji replikacijski kompetentni virus, RCASBP odstranjen onkogen src, koji je zamijenjen mjestom za restrikcijsku endonukleazu Cla I replikacijsko defektni vektori RETROVIRALNI VEKTORI

11. RCASBP(A) retroviralni vektor RCASBP(A) GFP Dlx5 Msx2 GFP Dlx5 Msx2

12. RCASBP(A) • nose do 2,4 kb velike slijedove • interakcija staničnog receptora i glikoproteina virusne ovojnice • prepisivanje virusne RNA u dvolančanu DNA • integracija u genom domaćina

13. TRANSGENIČNI MIŠ b-AKE • sadrži gen za stanični receptor za podjedinicu A, RCASBP(A) vektora • spojen na b-aktinski promotor • ptičji retroviralni vektor moći će se vezati na stanice ovog miša te tako omogućiti infekciju

14. CILJ (1) • infekcija koštanih stanica iz kalvarija i koštane srži transgeničnog miša b-AKE, s RCASBP(A)-GFP (eng. green fluorescent protein) retroviralnim ptičjim vektorom • testiranja učinkovitosti infekcije b-AKE transgeničnih miševa s navedenim ptičjim retroviralnim vektorima.

15. CILJ (2) • analiza učinka transkripcijskog čimbenika Dlx5 na razvoj osteoblasta na modelu primarne kulture koštanih stanica podrijetlom iz kalvarija (parijetalna i okcipitalna kost lubanje) b-AKE transgeničnih miševa, inficiranih RCASBP(A)-Dlx5 retroviralnim replikacijskim vektorom.

16. CILJ (3) • analiza učinka transkripcijskog čimbenika Dlx5 na razvoj osteoblasta na modelu primarne kulture koštanih stanica podrijetlom iz koštane sržib-AKE transgeničnih miševa, inficiranih RCASBP(A)-Dlx5 retroviralnim replikacijskim vektorom.

17. CILJ (4) • ispitivanje uloge transkripcijskog čimbenika Msx2 na razvoj osteoblasta na modelu primarne kulture koštanih stanica podrijetlom iz kalvarija b-AKE transgeničnih miševa, inficiranih RCASBP(A)-Msx2retroviralnim replikacijskim vektorom.

18. CILJ(5) • analiza prekomjerne izraženosti Dlx5 na aktivnost promotora kolagen tipa I u miševa dobivenih križanjem transgeničnih b-AKE i COLCAT3,6 miševa, a koji su inficirani RCASBP(A)-Dlx5 retroviralnim vektorom

19. ANALIZA KOLAGENSKOG PROMOTORA (COL1A1) • transgenični miš COLCAT 3.6, nosi COLCAT 3.6, roditeljski izvorni promotor spojen s reporter genom koji kodira kloramfenikol acetil transferazu • aktivnost CAT reporter gena može se jednostavno mjeriti provođenjem CAT assay metode, te tako odražava aktivnost samog promotora za koji je vezan

20. križanjem COLCAT3,6 i b-AKE transgeničnih miševa dobit će se COLCAT3,6/b-AKE transgenični miševi • transgenični miševi COLCAT3,6/b-AKE mogu se inficirati RCASBP(A) retroviralnim ptičjim vektorom

21. SADRŽAJ ISTRAŽIVANJA(1) • kulture koštanih stanica b-AKE transgeničnih miševa će se kroz tri dana inficirati s RCASBP(A)-GFP retroviralnim vektorom • reporter gen zeleni fluorescentni protein (GFP safir) će se detektirati s pomoću fluorescentne mikroskopije • RCAS(BP)A bez umetnutog GFP reporter gena služit će kao kontrola

22. SADRŽAJ ISTRAŽIVANJA (CILJ 2-4) • Dlx5 i Msx2 će se infekcijom RCASBP(A)-Dlx5 ili Msx2 retroviralnim vektorom unijeti u kulture koštanih stanica dobivenih iz kalvarija i/ili koštane srži b-AKE miševa • kontrola je infekcija s RCASBP(A) bez Dlx5 ili Msx2 • u različitim vremenskim intervalima će se iz kultura stanica izdvajati glasnička RNA • hibridizirati na sonde različitih koštanih biljega • ukupna mRNA će se odrediti hibridizacijom s 18S RNA sondom

23. SADRŽAJ ISTRAŽIVANJA (CILJ 5) • transgenični miševi dobiveni križanjem COLCAT3,6 i b-AKE miševa • infekcija kultura stanica kalvarija s RCASBP(A)-Dlx5 retroviralnim vektorom • aktivnost CAT reporter gena će se mjeriti provođenjem CAT assay metode u različitim vremenskim intervalima

24. METODE ISTRAŽIVANJA • transgenični miševi (b-AKE i COLCAT3,6/b-AKE) • RCASBP(A) virusni vektori i infekcija primarnih kultura stanica • primarna kultura stanica osteoblasta iz mišjih kalvarija • primarna kultura stanica koštane srži miša • izolacija i analiza mRNA iz kultura stanica • mjerenje aktivnosti CAT-reporter gena (CAT assay)

25. OČEKIVANI REZULTATI • CILJ(1): infekcijab-AKE transgeničnih miševa s navedenim ptičjim retroviralnim vektorima bi trebala biti učinkovita • CILJ(2 i 3):Dlx5 bi trebao uzrokovati pojačano sazrijevanje osteoblasta ogledano kroz izraženost najznačajnijih koštanih biljega u stanicama podrijetlom iz kalvarija i koštane srži b-AKE miševa

26. OČEKIVANI REZULTATI • CILJ(4):pretpostavka je da će učinak Msx2 na sazrijevanje kosti biti inhibitoran, ogledano kroz izraženost najznačajnijih koštanih biljega u stanicama podrijetlom iz kalvarija b-AKE miševa • CILJ(5):Dlx5 bi trebao poticati aktivnost CAT reporter gena u COLCAT3,6/b-AKE transgeničnim miševima

27. ZNANSTVENI DOPRINOS • dokaz uspješnosti infekcije eksperimentalnog modela b-AKE transgeničnih miševa s RCAS-BP(A) retroviralnim vektorima omogućit će uporabu ovog modela u daljnjim eksperimentima • daljnja analiza učinka Dlx5 i Msx2 na funkciju osteoblasta u miševa doprinijeti će dodatnom shvaćanju regulacije ovih složenih koštanih molekularnih interakcija

28. ZNANSTVENI DOPRINOS • razumijevanje utjecaja pojedinačnih transkripcijskih čimbenika u koštanoj biologiji može biti presudno u razmatranju molekularne osnove koštanih bolesti • svako novo saznanje u ovom istraživačkom polju predstavlja dodatnu kariku koja čini snažan lanac u razvoju i aplikaciji genske i stanične terapije u budućnosti