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广东医学院 2003 级 硕士研究生开题报告

广东医学院 2003 级 硕士研究生开题报告. p16 在宫颈癌发生中的作用及其机制的研究. 研究生： 邓飞 导师： 胡新荣 教授 时间： 2004 年 10 月 22 日. 立题依据. 肿瘤的发生是一个多因素、多步骤的长期过程，其中多个基因的改变导致细胞周期失调，细胞增殖失控在肿瘤形成的过程中发挥了重要作用。 p16 基因又称 MTS1 （多肿瘤抑制基因）是人们发现的第一个直接作用于细胞周期，抑制细胞分裂的基因。

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广东医学院 2003 级 硕士研究生开题报告

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Presentation Transcript

  1. 广东医学院2003级硕士研究生开题报告

  2. p16在宫颈癌发生中的作用及其机制的研究 • 研究生： 邓飞 • 导师： 胡新荣 教授 • 时间： 2004年10月22日

  3. 立题依据

  4. 肿瘤的发生是一个多因素、多步骤的长期过程，其中多个基因的改变导致细胞周期失调，细胞增殖失控在肿瘤形成的过程中发挥了重要作用。肿瘤的发生是一个多因素、多步骤的长期过程，其中多个基因的改变导致细胞周期失调，细胞增殖失控在肿瘤形成的过程中发挥了重要作用。 • p16基因又称MTS1（多肿瘤抑制基因）是人们发现的第一个直接作用于细胞周期，抑制细胞分裂的基因。 • p16在诸多肿瘤中的改变，使它在肿瘤发生中的作用日益受到人们的重视。

  5. 一、p16的基因结构和功能

  6. 1、p16的基因结构 • p16基因定位于9p21，全长8.5kb，由三个外显子和两个内含子构成，三个外显子的长度分别为126、307、11bp，其cDNA全长450bp。p16基因启动子和外显子1、2含有多个可甲基化的5’－CpG岛。 • p16基因编码产物p16蛋白，由148个氨基酸构成，为16kd

  7. 2、p16的功能 P INK4A RB RB P E2F E2F p16 P CDK4/6 P P 竞争性抑制 cyclinD1 cyclinD1 cyclinD1 CDK4/6 CDK4/6 P CDK4/6 CDK

  8. 二、p16与肿瘤

  9. 研究表明，p16基因的缺失、突变和甲基化存在于多种人肿瘤细胞，提示其与肿瘤的发生、发展有着密切的关系。研究表明，p16基因的缺失、突变和甲基化存在于多种人肿瘤细胞，提示其与肿瘤的发生、发展有着密切的关系。

  10. p16除了调节细胞周期，抑制细胞异常增殖以外，还与肿瘤细胞中端粒酶活性的调节和肿瘤细胞的永生化有关。p16除了调节细胞周期，抑制细胞异常增殖以外，还与肿瘤细胞中端粒酶活性的调节和肿瘤细胞的永生化有关。

  11. 大量的实验证据使人们相信在大多数肿瘤中p16扮演者抑癌基因的角色。大量的实验证据使人们相信在大多数肿瘤中p16扮演者抑癌基因的角色。

  12. 三、p16与宫颈癌

  13. 宫颈癌是妇女常见肿瘤之一，其发生机制尚不清楚。对于p16与宫颈癌关系的研究，已成为近几年来宫颈癌发生机制研究中的热点。宫颈癌是妇女常见肿瘤之一，其发生机制尚不清楚。对于p16与宫颈癌关系的研究，已成为近几年来宫颈癌发生机制研究中的热点。

  14. 同在大多数肿瘤中一样。p16基因也被认为在宫颈癌发生中的扮演着抑癌基因的角色，其主要依据有 ： • 1、宫颈肿瘤组织中，普遍都能检测到p16基因的失活。 • 2、p16基因及其编码蛋白在体外实验中能抑制宫颈癌细胞系的生长。

  15. 然而，在对p16的进一步研究中，人们用免疫组化检测临床病例标本的p16蛋白表达后发现，p16蛋白的表达会随着宫颈癌病情的进展而呈现逐渐升高的趋势 。

  16. 这一发现使人们对p16在宫颈癌发生中的作用产生了疑问：这一发现使人们对p16在宫颈癌发生中的作用产生了疑问： （1）p16在宫颈癌发生过程中起什么作用，是否与在其他肿瘤中一样起着抑癌作用。 （2）如果p16是抑癌基因，为什么其失活率随宫颈癌的发生而逐渐增加的同时，表达也逐渐升高。

  17. 以上问题迄今为止，都还没有得到满意合理的解释，国内也缺乏此类相关研究。本实这些验即是针对以上问题展开初步的探讨。以上问题迄今为止，都还没有得到满意合理的解释，国内也缺乏此类相关研究。本实这些验即是针对以上问题展开初步的探讨。

  18. 实验目的

  19. 1、研究p16在宫颈癌的发生过程的表达趋势。 2、研究p16在宫颈癌发生中的作用及机制。

  20. 拟解决的关键问题

  21. 1、p16在宫颈癌发生过程中表达是否升高。 2、高表达的p16与cyclinD1竞争性结合CDK4/6的能力是否改变。 3、p16高表达与pRb磷酸化的关系。 4、体外实验中p16表达对cyclinD1与CDK4/6的结合能力及pRb的磷酸化水平的影响。

  22. 拟采取的研究方法

  23. （1）IHC （2）CO-IP、IP、western-blot （3）siRNA转染宫颈癌细胞系

  24. 技术路线

  25. 一、临床实验

  26. 1、p16表达的检测： 图像 分析 癌前病变 临 床 病 例 标 本 P16 的 表 达 趋 势 同一组织来源 宫颈癌 切片、HE p16 不同组织来源 癌前病变 IHC 宫颈癌

  27. 2、p16功能检测 CO-IP、 western p16高表达的宫颈癌标本 提取组织块 中的蛋白质 P16低表达的宫颈癌标本 IP western pRb-P p16-CDK4/6 对比不同组的 结果，研究p16 表达升高对其 功能的影响。 对比不同组结果， 研究p16表达与pRb 磷酸化的关系

  28. 二、体外实验

  29. siRNA 腺病毒转染 p16高表达的 宫颈癌细胞 p16表达缺失的 宫颈癌细胞 筛选 CO-IP、IP、western-blot CyclinD1-CDK4/6 pRb-P CyclinD1-CDK4/6 pRb-P 对比分析 得出结论

  30. 预期结果

  31. 1、p16在宫颈癌的发生过程中表达逐渐升高。 • 2、临床实验中，p16高表达组比低表达组，p16与CDK4/6的结合增加，pRb的磷酸化水平升高。 • 3、体外实验中，转染前后，cyclinD1与CDK4/6的结合增加，pRb的磷酸化水平降低，

  32. 进度安排

  33. 2004.10－2005.7 临床病理标本的收集。细胞系的筛选，细胞转染及转染后筛选。 • 2005.8－2006.1 IHC、CO-IP、IP、western-blot。 • 2006.2－2006.4 结果分析，撰写论文，准备答辩。

  34. 经费预算

  35. 免疫组化 2000元 • 免疫沉淀 5000元 • Western-blot 3000元 • 细胞培养 2000元 • siRNA转染 25000元* • 总计 37000元

  36. 请老师同学多提宝贵意见

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