第六章蛋白印记（ Western blotting ）

第六章蛋白印记 （Western blotting）

一、实验目的熟悉免疫印迹的原理和用途，学习免疫印记的操作技术和结果判定方法。一、实验目的熟悉免疫印迹的原理和用途，学习免疫印记的操作技术和结果判定方法。

二、原理印迹法：将生物大分子物质通过不同的途径转移到固相载体上，转移后的固相载体经淬灭试剂处理后，用适当的溶液漂洗，置于含底物或探针的溶液中孵育，可与对于的探针反应，显出特异条带。二、原理印迹法：将生物大分子物质通过不同的途径转移到固相载体上，转移后的固相载体经淬灭试剂处理后，用适当的溶液漂洗，置于含底物或探针的溶液中孵育，可与对于的探针反应，显出特异条带。

二、原理常见的印记法有Southern、Northern、Western印迹法，分别用于检测DNA、RNA和蛋白质。 其中Western印记又称为免疫印迹。

二、原理 其中，免疫印迹的基本原理是将凝胶电泳与固相免疫相结合，其主要的操作分为三个过程：

二、原理1）电泳：SDS-PAGE分离各蛋白组分；2）印记：将蛋白质从凝胶转移到固相载体；3）免疫检测：依次与一级抗体和标记的二抗体反应，通过底物或激发光激发显色，观察目的条带的有无。二、原理1）电泳：SDS-PAGE分离各蛋白组分；2）印记：将蛋白质从凝胶转移到固相载体；3）免疫检测：依次与一级抗体和标记的二抗体反应，通过底物或激发光激发显色，观察目的条带的有无。

二、原理 制备gel 处理Sample 实验流程: Loading sample SDS-PAGE Gel转印硝酸纤维素膜将gel移入staining solution Western blotting HRP detection destaining solution 直到染色对比清晰为止 Data判读 Data判读

Stacking gel 5% Acrylamide ( Tris-HCl, pH6.8) Separating gel 12 % Acrylamide (Tris-HCl, pH8.8) Running buffer : Tris-HCl, glycine, pH 8.3 二、原理 Discontinuous Gel Electrophoresis

二、原理 转印及免疫染色流程：转印三明治免疫染色流程及结果塑料夹板转印抗体定性滤纸 HRP-二抗黑色透明转印滤膜 NC膜海绵垫显色

二、原理优点：SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性。用途：常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。二、原理优点：SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性。用途：常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。

二、原理不足：操作要求高成本高 结果判断主要依据条带的有无以及条带的亮度

二、原理 本次实验以APP分泌性蛋白和菌体蛋白为检测抗原，通过免疫印迹方法初步了解免疫血清中针对APP的抗体种类及含量。

三、材料1.待检抗原：APP分泌性蛋白和菌体蛋白 2.SDS-PAGE凝胶3.1×Tris-Gly电泳缓冲液4.预染蛋白质Marker 5.考马斯蓝染色液

三、材料6.考马斯蓝脱色液7.转印缓冲液8.硝酸纤维素滤膜9.定性滤纸10.1×TBST洗涤液三、材料6.考马斯蓝脱色液7.转印缓冲液8.硝酸纤维素滤膜9.定性滤纸10.1×TBST洗涤液

三、材料11.封闭液：5%脱脂牛奶12.一级抗体：兔抗APP免疫血清13.二级抗体：HRP标记羊抗兔IgG14.显色剂：3,3’-二氨基联苯胺（DAB）（A+B，使用前混合）15.终止液：蒸馏水三、材料11.封闭液：5%脱脂牛奶12.一级抗体：兔抗APP免疫血清13.二级抗体：HRP标记羊抗兔IgG14.显色剂：3,3’-二氨基联苯胺（DAB）（A+B，使用前混合）15.终止液：蒸馏水

四、操作步骤1.SDS-PAGE凝胶制备及蛋白质样品的处理：略。四、操作步骤1.SDS-PAGE凝胶制备及蛋白质样品的处理：略。

四、操作步骤2.电泳分离： 在第1至12孔中分别加入：菌体－分泌蛋白-Marker-空白-Marker-分泌蛋白-菌体-空白-空白-Marker-分泌蛋白-菌体。

四、操作步骤2.电泳分离： 将电泳装置与电源相接，80V，30min；换120V，待溴酚蓝刚移出分离胶底部时关掉电源（约90min）。

四、操作步骤3.转印： 电泳结束后，将凝胶转移至洁净塑料薄膜表面，用钢尺切取1～7孔，剔除浓缩胶，量取实际转膜用胶块大小（长×宽）。剩余凝胶用染色液浸泡。

四、操作步骤3.转印：戴上手套，切4张定性滤纸和1张NC膜。用蒸馏水润湿定性滤纸和NC膜，用铅笔在滤膜一角做标记（组号）。四、操作步骤3.转印：戴上手套，切4张定性滤纸和1张NC膜。用蒸馏水润湿定性滤纸和NC膜，用铅笔在滤膜一角做标记（组号）。滤纸和NC膜的大小与凝胶相同或略小

四、操作步骤3.转印： 安装转印装置：夹板（黑色）-海绵垫-2层滤纸-凝胶-NC膜-2层滤纸-海绵垫-夹板（白色），固定，通电，调80V，转印1小时。每加一层都需准确对齐，并排尽气泡。

四、操作步骤4.封闭 转印结束后，取出NC膜放入洁净平皿，加入封闭液20mL，平放于摇床上室温反应1小时。

四、操作步骤5.洗涤 用眼科镊夹住硝酸纤维素滤膜某角，放入另一洁净平皿，加入洗涤液15mL，置摇床上5min，换新的洗涤液；共洗涤3次。

四、操作步骤6.加一抗 把NC膜放入一新的平皿中，加入用TBST以1:40稀释的免疫血清15mL，平放于摇床上室温反应30min。之后洗涤滤膜3次。

四、操作步骤7.加二抗 把NC膜放入一新的平皿中，加入用TBST以1:5000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG 10ml，室温反应30min。之后，NC膜用TBST洗涤3次，再用TBS洗涤2次。

四、操作步骤8.显色 配制显色液2mL，把NC膜放入显色液中，显色1～15 min，一旦出现条带，立即将NC膜转至蒸馏水中，终止酶促反应，即可观察。可用成像系统或相机拍摄图片。

四、操作步骤10.结果判读：观察共出现多少条杂交带，各条带分子量大小约为多少？ 与蛋白质考马斯蓝染色结果对比，看看是那些区段的蛋白出现显色反应？蛋白量与显色强度关系？

五、思考题 1.为什么滤纸必须与凝胶大小完全一致？ 2.转印时为什么都必须带手套并排气泡？ 3.在显色时应注意哪些问题？ 4.请简述免疫印迹的原理，并将之与免疫学相关概念联系起来。

第六章蛋白印记（ Western blotting ）