模拟感染家蚕微粒子病的 PCR 分子诊断技术演示实验

1. 模拟感染家蚕微粒子病的PCR分子诊断技术演示实验模拟感染家蚕微粒子病的PCR分子诊断技术演示实验 刘吉平、曹阳、Smith J.E、郝娟 英国国际发展部DFID项目和广东省科学技术厅国际合作配套项目（2001.3-2004.4）

2. 家蚕微粒子病诊断沿革 1桑蚕微孢子虫（Nosema bombycis，简称Nb）------ 家蚕微粒子病原 法国学者Louis Pasteur （1870）：母蛾镜检法 现在中国广东蚕种生产环节：母蛾集团检验法 70年代以来，各种的免疫学诊断法 90年代以来，应用PCR技术、核酸杂交方法 用于家蚕微粒子病的检验和诊断 2 近缘微孢子虫对家蚕的交叉感染 光镜、显微镜的形态学鉴别及分类 血清学方法、组织免疫学方法的鉴别及分类 分子生物学方法的应用 ----PCR分子标记鉴别和核酸分子杂交鉴别 3 存在问题 （1）家蚕微孢子病的诊断：目前仍然以母蛾集团检验法为有效的方法，分子诊断方法 的灵敏度、有效性、准确性、实用性和可操作性没有解决 （2） 家蚕微孢子虫病原的分子系统发育学研究结果与形态学分类鉴别结果的异同比较 存在 困难 4 关键原因分析 分子生物学诊断方法的标记基因和标记序列的特异性/代表性

3. PCR的原理 • Polymerase Chain Reaction Amplification(PCR)技术可以根据任何一段DNA片段的两端已知序列设计引物（Prime），将目的DNA片段进行PCR扩增放大，达到电泳可检测、可回收的数量级。

4. 可选用的家蚕微孢子虫PCR特异引物设计 • 1 caccaggttg attctgcctg acgtagacgc tatactctaa gattaaccca tgcatgttta • V1f(1-22) / mP1F • 61 ttgaatataa agaaaagacg aacagctcag taactcttat ttgatttgat gtattaggat • 121 tctaactatg ttaaattata ggtaacaata atacaataag aataagatct atcagttagt • 181 tgttaaggta atggcttaac aagactatga cggataacgg tattactttgtaatattccg • 299f(224-244) • 241 gagaaggagc ctgagagatt gctactaagt ctaaggattg cagcaggggc gaaacttgac • 301 ctatgatatt atattgaggc agttatgagt agtattttat aattattgta gtattgtaag • 530f(395-410) • 361 tacatattac aagataaatc ggagggcaaa tcgagtgccagcagccgcgg taatacttgt • 530r(395-410) • 421 tccgatagtg tgtatgatga ttgatgcagt taaaaagtct gtagtttatt tataataagc • 481 attgtaaggt atactgtatg gttaggagag agatgaaatg tgataaccctaactggatga • 647r(526-544) • 541 acagaagcga aagctgtata cttaaatgta ttattagaac aaggacgtaagctagaggat • HG2f(585-606) • 601 cgaagatgat tagataccat tgtagttcta gcagtaaact atgttgaatc atagatatat • 661 tttgatatat atttatgtag agaaattaag attatattga ctctggggat agtatgatcg • 721 caagattgaa aattaaagaa attgacggaa gaataccaca aggagtggat tgtgcggctt • 781 aatttgactc aacgcggggt aatttaccag gtataacatg atataatatt ttatcatgat • 964r(771-796) • 841 agtggtgcat ggccgtttcc aatggatgct gtgaagtaat gattaatttc aacaagatgt • 901 gagaccctca tttagacaga tgtagtgata catatgaagg agaggattaa aacaggtccg • 961 ttatgcccta agataatctg ggttgcacgc gcaatacaat aatatttgat attataaggg • 1021 ataatataat gtaagatata tttgaacatg gaattgctag taaattttat ttaataagta • 1081 gaattgaatg agtccctgtt ctttgtacac accgcccgtc gctatctaag atggtattat • 1141 ctatgaacaa atttataaag tgaatagata gtactagatc tgatataagt cgtaacaagg • mP2r(1178-1204) t • 1201 ttgctgttgg agaaccatta gcaggatcat aa • 1537r(1212-1232) • Fig.1 Primers in the position of small subunit rRNA gene of Nosema bombycis isolate:SES-NU • (Genbank accession:D85503)

5. 家蚕微粒子病分子诊断演示实验内容 • 1 实验材料 • 桑蚕微孢子虫（N.b）悬浮液(约107~9/ml) • 小菜蛾微孢子虫、斜纹夜蛾微孢子虫 • 显微镜检验法确认的蚕种（卵）、未感染和感染家蚕微粒子病的蚕蛾研磨液 • （已经收集广东蚕区样品16个，其中10个样有微孢子虫，一个样有类似孢子，其余5个样品未检到孢子） • 2 供试引物 检 测微孢子虫小亚单位核糖体（ssu rDNA）的一对引物（V1F/530R ）： VIF：5’—CAC CAG GTT GAT TCT GCC TGA C—3’ • 530R：5’—CCG CGG CTG CTG GCA C—3’ • 3 PCR反应体系 • PCR反应专用水(nuclease-free water) 15.205ul • MgCl2（25mmol/L） 0.67ul • Tag酶试剂盒中绿色PCR缓冲液(5×GoTag TM Reaction Buffer) 5ul • GoTag TMDNA Polymerase (5u/ul) 0.125ul • dNTP Mix(溶度为10mM) 1.0 ul(终溶度为0.2 mM) • 引物LCO1490/HCO2198（每引物浓度为10pmol） 各1.0ul • 模板DNA（约10.0ng/μl） 1.0ul • 25ulPCR反应体系

6. 4 PCR反应参数 • 94℃变性5min后，40个循环为： • 94℃ 1min，40℃ 1min10second，72℃ 1.5min • 最后72℃延伸10min • 5 模板DNA制备（核酸抽提） • 1)取100μl N.b纯孢子（3x108/ml）或蚕蛾组织研磨液 • 2)6000rpm离心5min,弃上清； • 3)N.b孢子或蚕组织沉淀用2%CTAB的溶液400μl重悬，研磨2~3min • 4)加蛋白酶K（20mg/ml）约20μl, 振荡20~30秒，55℃保温4hr以上或过夜 • 5)冷却至室温后，直接加300ul氯仿，振荡混匀后13200rpm离心10分钟。 • 6)上清液加 100ul蛋白质沉降液（Protein Precipitation Solution），振荡20~30秒混匀， 冰块上保持5分钟后13200rpm离心4分钟； • 7)上清液（含DNA）再加300ul 室温保存的100%甲醇溶液（Isoporopanol），4℃保持1小时以上，然后13200rpm离心5分钟；小心弃去上清液。 • 8)DNA沉淀再用70%乙醇300μl洗离1次。然后将离心管倒置于干净的纸巾上，让其自然凉干（10~15分钟）； • 9)最后每样品的DNA沉淀溶于100μl干净的去离子无菌水中，4℃冰箱保存过夜后，即可作为PCR模板DNA；如要保证较长时间使用DNA的质量，则必须置-20℃冰箱保存。

7. 实验结果 广东生产上镜检发现的几种病原性微孢子虫 PCR扩增检验结果