Taller Nacional Santiago, 27 de octubre – 7 de noviembre de 2008

1. Proyecto Regional TCP/RLA/3107Desarrollo de Bases de Datos y Tablas de Composición de Alimentos de Argentina, Chile y Paraguay para fortalecer el comercio internacional y la protección de los consumidores Taller Nacional Santiago, 27 de octubre – 7 de noviembre de 2008

2. Contenido de Agua y Materia Grasa Prof. Lilia Masson Salaue lmasson@ciq.uchile.cl Universidad de Chile, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas , Centro de Investigación y Desarrollo en Grasas y Aceites, CIDGRA Departamento de Ciencia de los Alimentos y Tecnología Química,

3. Métodos de determinación de agua en un alimento o bebida • La determinación del porcentaje de agua en un alimento natural o procesado tiene diversas connotaciones: • 1.- Es la base de referencia para calcular su aporte energético a partir de los porcentajes de macronutrientes: • Proteínas • Hidratos de carbono • Materia grasa: AG Sat. Monoinsat. Poliinsat. ω6, ω3, AG.trans, colesterol

4. Es la base del etiquetado nutricional en la expresión porcentual o por porción, no sólo de macronutrientes sino de: • - Cenizas o contenido mineral • - Fibra dietaria • - Micronutrientes: minerales y vitaminas • - Componentes bioactivos

5. Información complementaria • Contaminantes inorgánicos y orgánicos • Componentes tóxicos naturales o generados en el procesamiento

6. Importancia de su determinación • Es la base de referencia para: • Caracterizar un alimento • Comparar alimentos en base seca o a un contenido de agua fija pre-determinada • Realizar estudios de variaciones estacionales que se producen en diversos alimentos, como peces grasos, en que la relación agua, contenido graso es inversa, manteniéndose constante el contenido proteico • Extracción de materia grasa en alimentos frescos

7. Métodos de determinación de humedad • Los métodos para determinar el contenido de agua en alimentos naturales y procesados se basan en la medida directa o indirecta del agua retirada de un alimento • La medición de algunas propiedades físicas del alimento que cambian sistemáticamente con el contenido de agua

8. La medición de la reactividad química del agua

9. Métodos de secado • Los métodos de secado son mas convenientes para alimentos que se están analizando con fines nutricionales • La liofilización o secado por congelación ofrece la ventaja que el agua se retira bajo condiciones muy suaves • El tejido deshidratado puede emplearse para la determinación de diversas sustancias y es fácil de homogeneizar

10. El material liofilizado es liviano y fácil de transportar • Desventaja: Los liofilizadores son caros • El agua residual debe retirarse de la muestra liofilizada por presión reducida • O sobre desecantes adecuados • Esto añade una segunda etapa en el análisis

11. El desecado de la muestra en estufa de vacío entre 60 – 70ºC es más eficiente, si una corriente de aire seco lenta se pasa a través del horno. • Tiene la ventaja que las porciones analíticas pueden mantenerse por un tiempo (toda la noche) antes de su posterior tratamiento

12. Requieren mínima intervención del personal del laboratorio • Costos de capital bajos • Este método es preferible al secado en estufa de aire forzado a 100-105ºC, un procedimiento ampliamente usado y de bajo costo

13. Secado en aire a presión normal • No es conveniente para muchos alimentos • Especialmente los con alto contenido de azúcares que puede caramelizar • Grasas que pueden sufrir oxidación o pérdida de materias volátiles como aceites o aceites esenciales

14. Secado en microonda • Ofrece la ventaja de la rapidez • Requiere permanente vigilancia del personal del laboratorio para prevenir que la muestra se queme

15. Método termovolumétrico • Método de destilación por arrastre de vapor con tolueno o xilol de acuerdo a Dean y Stark • Es aplicable a muchos alimentos y sobre todo a los que contienen cantidades significativas de compuestos volátiles diferentes al agua como las especias, que contienen aceites esenciales

16. Método químico • Karl Fisher. Tiene una exactitud mayor que la necesaria para un análisis nutricional de un alimento • Es útil en alimentos de muy bajo contenido de agua, menos de 5 %, principalmente los higroscópicos.

17. Métodos Instrumentales • Se basan en una propiedad física del alimento • Alta velocidad en la obtención de resultados • Ej: NMR, NIR, Irefracción Se emplean en laboratorios que manejan un alto número de muestras de alimentos similares Tienen mayor aplicación en alimentos de humedad intermedia 5 - 20%. Requieren de una correcta calibración contra un material de referencia conocido patrón.

18. ADVERTENCIA! • Todos los métodos de secado liberan compuestos volátiles junto con el agua. Y deben hacerse correcciones por volátiles obvios como el etanol.

19. Métodos para determinar Materia grasa • Grasa Total • La grasa de un alimento consiste de un número de diversos compuestos tanto unidos como libres. • Encontrar un método que como una entidad única. mida la “ grasa total”, normalmente presenta bastante problemas

20. Por lo tanto, hay diversos métodos disponibles y que se practican habitualmente en los laboratorios analíticos • Los valores obtenidos por cada método para “ grasa total” dependen en gran medida del método empleado, especialmente en el caso de alimentos bajos en grasa.

21. Métodos de extracción con solvente • Soxhlet es de extracción discontinua • Butt extracción continua • Se debe trabajar sobre muestra seca en el laboratorio • Tienen aplicación limitada, no son los mas recomendados, dado que en muchos alimentos naturales y especialmente los procesados la materia grasa se une a carbohidratos y proteínas

22. Hay muchos tejidos que contienen cantidades importantes de fosfolípidos • Gran consumo de tiempo • Extracciones incompletas especialmente en cereales

23. Las muestras están sometidas a altas tº por tiempos prolongados • No es recomendable para materias grasas altamente poliinsaturadas • Es método oficial para la extracción de aceite de semillas • Variante Método Foss automático usa tetracloro etileno para extraer la rasa rápidamente • Ha funcionado bien en productos cárneos

24. Problemas adicionales • Uso de solventes inflamables: • Éter etílico, éter de petróleo, hexano • Son solventes tóxicos • Los valores del extracto graso no son los mismos si se usa eter etílico que es mas polar que hexano o éter de petróleo 40-60ºC que son menos polares • CONLUSIÓN • Empleo de Métodos alternativos

25. Métodos Alternativos • Empleo de mezcla de solventes polares y no polares • Método de Bligh y Dyer y de Folch • Ambos extraen los lípidos en forma más completa, pues extraen los fosfolípidos • Dependiendo de la muestra a veces se requiere una purificación del extracto

26. Aplicaciones: • En nuestra experiencia cuando se va a estudiar o a investigar los lípidos del extracto, como composición en ácidos grasos, tocoferoles, fitosteroles, pigmentos carotenoides, clorofila, se recomienda aplicar estos Métodos. • Para Alimentos aplicamos normalmente Bligh y Dyer • Para fluidos biológicos: plasma. glóbulos rojos Folch

27. Fundamento • Cuando se tiene un alimento húmedo y se homogeniza con una mezcla de cloroformo metanol en determinadas proporciones, que son Cloroformo: Metanol : Agua 1:2:0.8 se forma entre los tres solvente un sistema miscible. • Este sistema permite extraer los componentes lipídicos del tejido, sean triglicéridos, fosfolípidos, derivados lipídicos, etc. en su totalidad. • Esta primera extracción exige que la matriz del alimento a extraer contenga 80% de humedad

28. Para lo cual es requisito indispensable determinar previamente el contenido de agua del alimento y ajustar a 80% en caso necesario • Una vez efectuada la primera homogeneización y extracción simultánea de la materia grasa del alimentos con la mezcla cloroformo, metanol, agua en la proporción señalada, se desestabiliza esta mezcla homogénea de solventes por adición de 1 parte adicional de cloroformo y 1 parte de agua, se llega a esta proporción: • Cloroformo: Metanol: Agua = 2:2:1.8

29. En esta proporción se desestabiliza la mezcla terciaria de los tres solventes y se separa la capa clorofórmica que disuelve los lípidos y la fase agua /metanol que no disuelve lípidos. • Se descarta la capa metanol/ agua y los lípidos quedan en la capa clorofórmica

30. Se mide el volumen de cloroformo en una probeta adecuada, se toma una alícuota, se evapora el cloroformo y se pesa el residuo para calcular el % de materia grasa. • Otra alternativa es evaporar la totalidad el cloroformo en evaporador rotatorio empleando un matraz o balón tarado. Por diferencia de peso se obtiene el contenido graso extraído y se calcula el % de grasa de la muestra

31. El Método de Folch que se basa en el mismo principio lo aplicamos para extraer los lípidos de fluídos biológicos como plasma, suero, o de elementos figurados como membrana de glóbulos rojos. • En este caso los fluidos tienen del orden de 80% de humedad y no se requiere el ajuste

32. En el caso de determinar contenido graso en alimentos que tienen los lípidos unidos a hidratos de carbono y/o proteínas, como es el caso de los alimentos procesados sometidos a altas tº como horneado, fritura, deshidratado, extruído, etc, nosotros aplicamos método de hidrólisis ácida. • La muestra fresca homogeneizada se pesa, se trata con alcohol, se calienta en baño de agua entre 70-80ºC por 20 minutos para hidrolizar las uniones proteicas y de hidratos de carbono que tienen incluida la materia grasa y no hidrolizar la unión éster del ácido graso con el glicerol que constituye los triglicéridos

33. Luego de la hidrólisis, el líquido se traslada a embudo de decantación o tubo de Mojonnier para proceder a la extracción de la materia grasa con éter etílico y éter de petróleo. • Los extractos etéreos se separan por decantación, hay que tener cuidado con la formación de emulsiones. • Los extractos etéreos se reciben en matraz tarado, se evapora el solvente en evaporador rotatorio y el residuo obtenido libre de solventes se pesa. Se controla peso constante por gaseado con Nitrógeno. • Se calcula el % de grasa de la muestra

34. APLICACIONES • Nosotros lo aplicamos a todo tipo de alimentos: carnes, embutidos, queso, galletas, harinas, alimentos formulados, chocolate, alimentos fritos, horneados, extruídos, etc. • Es un método universal, pero puede haber limitaciones en alimentos muy ricos en azúcar y en otros casos, una descomposición de fosfolípidos. • Método Oficial de la AOAC para varios alimentos • No lo aplicamos cuando se va a estudiar posteriormente los lípidos extraídos del alimento

35. Método de Hidrólisis Alcalina • Aplicación principal en Leche y derivados lácteos • Fundamento: • Los glóbulos de grasa están rodeados de una película de fosfolípidos que impide la extracción directa de la grasa con un solvente • Esta capa de fosfolípidos se destruye con un álcali suave como es una solución de amoníaco diluída

36. La muestra se transfiere a un embudo de decantación y se extrae de acuerdo al procedimiento con los solventes orgánicos. • Los extractos se reciben en matraz tarado, se evapora el solvente en evaporador rotatorio y se controla peso constante por diferencia de pesada. • Se calcula el % de materia grasa de la muestsra. • Este método está aprobado internacionalmente AOAC, FIL, para leche derivados lácteos

37. Métodos Instrumentales • FT NIR • Aplica la espectroscopia Infrarroja cercana para medir contenido graso en algunas matrices. Necesita calibración contra método oficial aplicado en la misma matriz. • NMR • Se ha desarrollado un método por NMR para medir contenido graso en semillas oleaginosas. • Es muy rápido, requiere calibración con las respectivas semillas. • Ambos son equipos de costo elevado

38. DETERMINACIÓN DE HUMEDAD Método de la estufa de aire

39. 1.- OBJETIVO Determinar el contenido de agua de la muestra. 2.- ALCANCE Y CAMPO DE APLICACIÓN El método es aplicable a alimentos sólidos, líquidos o pastosos no susceptibles a degradación al ser sometidos a temperaturas superiores a 105 ºC. Este método es inadecuado para productos ricos en sustancias volátiles distintas del agua. 3.- FUNDAMENTO El método se basa en la determinación gravimétrica de la perdida de masa, de la muestra desecada hasta masa constante en estufa de aire. 4.- REFERENCIAS 4.1 Instituto Nacional de Normalización, NCh 841 of 78 4.2 Official Methods of Analysis. A.O.A.C. 15th Edition 1990

40. 5.- TERMILOGIA N/A 6.- MATERIAL Y EQUIPO 6.1.- Balanza analítica, sensibilidad 0.1 mg 6.2.- Cápsulas de vidrio, porcelana o metálica, con tapa 6.3.- Desecador con deshidratante adecuado 6.4.- Estufa regulada a 103±2 ºC 6.5.- Material usual de laboratorio 7.- PROCEDIMIENTO 7.1.- Efectuar el análisis en duplicado 7.2.- Colocar la cápsula destapada y la tapa durante al menos 1 hora en la estufa a la temperatura de secado del producto. 7.3.- Empleando pinzas, trasladar la cápsula tapada al desecador y dejar enfriar durante 30 a 45 min. Pesar la cápsula con tapa con una aproximación de 0.1 mg. Registrar (m1).

41. 7.4.- Pesar 5 g de muestra previamente homogeneizada. Registrar (m2). 7.5.- Colocar la muestra con cápsula destapada y la tapa en la estufa a la temperatura y tiempo recomendado 105 ºC x 5 horas. 7.6.- Tapar la cápsula con la muestra, sacarla de la estufa, enfriar en desecador durante 30 a 45 min. 7.7.- Repetir el procedimiento de secado por una hora adicional, hasta que las variaciones entre dos pesadas sucesivas no excedan de 5 mg (m3).

42. 8.- CALCULO Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS La humedad del producto expresada en porcentaje, es igual a: m2 - m3 % Humedad = ---------------- x 100 m2 - m1 donde: m1: masa de la cápsula vacía y de su tapa, en gramos m2: masa de la cápsula tapada con la muestra antes del secado, en gramos m3: masa de la cápsula con tapa más la muestra desecada, en gramos Promediar los valores obtenidos y expresar el resultado con dos decimales. Repetibilidad: La diferencia de los resultados no debe ser superior al 5% del promedio. En el informe de resultado, se indicará método utilizado, identificación de la muestra, temperatura, tiempo de secado y resultado promedio obtenido de las muestras en duplicado.

43. DETERMINACIÓN DE PROTEINAS Método Kjeldahl

44. 1.- OBJETIVO Determinar la concentración de nitrógeno presente en la muestra para luego ser transformado a través de un factor en proteína. 2.- ALCANCE Y CAMPO DE APLICACIÓN El método es aplicable a alimentos en general. 3.- FUNDAMENTO El método se basa en la destrucción de la materia orgánica con ácido sulfúrico concentrado, formándose sulfato de amonio que en exceso de hidróxido de sodio libera amoníaco, el que se destila recibiéndolo en: a) Acido sulfúrico donde se forma sulfato de amonio y el exceso de ácido es valorado con hidróxido de sodio en presencia de rojo de metilo, o b) Acido bórico formándose borato de amonio el que se valora con ácido clorhídrico.

45. 4.- REFERENCIAS 4.1.- A.O.A.C. Official Methods of Analysis 13 th Edition, 1984. 4.2.- FAO Food and Nutrition Paper 14/7 Roma, 1986 5.- TERMINOLOGIA N/A 5.- MATERIAL Y EQUIPO 5.1.- Balanza analítica, sensibilidad 0.1 mg. 5.2.- Equipo Kjeldahl 5.3.- Manto calefactor 5.4.- pHmetro 5.5.- Material usual de laboratorio.

46. 6.- REACTIVOS 6.1.- Acido sulfúrico concentrado, p.a. 6.2.- Sulfato de potasio o sulfato de sodio, p.a. 6.3.- Sulfato cúprico, p.a. 6.4.- Solución de hidróxido de sodio al 15 % . Disolver 150 g de NaOH y completar a 1 litro. 6.5.- Solución de ácido sulfúrico 0.1 N. Tomar 2.7 mL de H2SO4conc. y completar a 1 litro, luego estandarizar con Na2CO3 anhidro p.a. 6.6.- Solución de hidróxido de sodio al 30 %. Disolver 300 g de NaOH y completar a 1 litro. 6.7.- Solución indicadora de rojo de metilo al 1 % en etanol. Disolver 1 g de rojo de metilo en 100 mL de etanol (95 %). 6.8.- Solución de hidróxido de sodio 0.1 N. Tomar 4 g de NaOH y enrasar a 1 litro con agua recientemente hervida y enfriada. Valorar con ácido succínico.

47. 6.9.- Acido bórico al 3 % . Disolver 30 g de ácido bórico y completar a 1 litro. 6.10.- Indicador de Tashiro: rojo de metilo al 0.1 % y azul de metileno al 0.1 % en relación de 2:1, en alcohol etílico. 6.11.- Solución de ácido clorhídrico 0.1 N. Tomar 8.3 mL de HClconc. y enrasar a 1 litro. Valorar con Na2CO3 anhidro. 7.- PROCEDIMIENTO 7.1.- Realizar la muestra en duplicado. 7.2.- Efectuar un ensayo en blanco usando una sustancia orgánica sin nitrógeno (sacarosa) que sea capaz de provocar la reducción de los derivados nítricos y nitrosos eventualmente presentes en los reactivos. 7.3.- Pesar al 0.1 mg. alrededor de 1 g de muestra homogeneizada (m) en un matraz de digestión Kjeldahl. 7.4.- Agregar 3 perlas de vidrio, 10 g de sulfato de potasio o sulfato de sodio, 0.5 g de sulfato cúprico y 20 mL de ácido sulfúrico conc.

48. 7.5.- Conectar el matraz a la trampa de absorción que contiene 250 mL de hidróxido de sodio al 15 %. El disco poroso produce la división de los humos en finas burbujas con el fin de facilitar la absorción y para que tenga una duración prolongada debe ser limpiado con regularidad antes del uso. Los depósitos de sulfito sódico se eliminan con ácido clorhídrico. Cuando la solución de hidróxido de sodio al 15 % adicionada de fenolftaleína contenida en la trampa de absorción permanece incolora debe ser cambiada (aprox. 3 análisis ). 7.6.- Calentar en manta calefactora y una vez que la solución esté transparente, dejar en ebullición 15 a 20 min. más. Si la muestra tiende a formar espuma agregar ácido esteárico o gotas de silicona antiespumante y comenzar el calentamiento lentamente. 7.7.- Enfriar y agregar 200 mL de agua. 7.8.- Conectar el matraz al aparato de destilación,agregar lenta- mente 100 mL de NaOH al 30 % por el embudo y cerrar la llave.

49. 7.9.- Destilar no menos de 150 mL en un matraz que lleve sumergido el extremo del refrigerante o tubo colector en: a) 50 mL de una solución de ácido sulfúrico 0.1 N, 4 a 5 gotas de rojo de metilo y 50 mL de agua destilada. Asegurar un exceso de H2SO4 para que se pueda realizar la retrotitulación. Titular el exceso de ácido con NaOH 0.1 N hasta color amarillo o b) 50 mL de ácido bórico al 3 %. Titular con ácido clorhídrico 0.1 N hasta pH 4.6 mediante un medidor de pH calibrado con soluciones tampón pH 4 y pH 7, o en presencia del indicador de Tashiro hasta pH 4.6 Cada cierto tiempo es necesario verificar la hermeticidad del equipo de destilación usando 10 mL de una solución de sulfato de amonio 0.1 N (6.6077 g/L), 100 mL de agua destilada y 1 a 2 gotas de hidróxido de sodio al 30 % para liberar el amoníaco, así como también verificar la recuperación destruyendo la materia orgánica de 0.25 g de L(-)-Tirosina. El contenido teórico en nitrógeno de este producto es de 7.73 %. Debe recuperarse un 99.7 %

50. 7.- CALCULO Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS 14 x N x V x 100 7.1.- % N = ----------------------- m x 1000 14 x N x V x 100 x factor 7.2.- % Proteína =--------------------------------- m x 1000 Donde: V : 50 mL H2SO4 0.1 N - gasto NaOH 0.1 N o gasto de HCl 0.1 N m : masa de la muestra, en gramos factor: 6.25: para carne, pescado, huevo, leguminosas y proteínas en general 5.7 : para cereales y derivados de soya 6.38: leche 5.55: gelatina 5.95: arroz Repetibilidad del método: La diferencia entre los resultados de dos determinaciones efectuadas una después de otra, por el mismo analista, no debe exceder 0.06 % de Nitrógeno o 0.38 % de proteína. En la planilla de resultados se indicará método utilizado, identificación de la muestra, peso de muestra, gastos de titulación, factor utilizado y resultados obtenidos de la muestras en duplicado con 2 decimales.