1 / 49

MTA SZBK DNS - Chip Laborat órium szbk.hu/chiplab~

MTA SZBK DNS - Chip Laborat órium www.szbk.hu/chiplab~. A DNS CHIPEK ÉS ALKALMAZÁSUK SZE Bioinformatika 2003.10.09. DNA-chip Lab.BRC, Szeged. Kromoszómák genetikai állomány hordozói. sejt. DNS. Gének információ hordozók. mRNS. AAAAAA. AAAAAA. AAAAAA. Fehérjék

lave
Download Presentation

MTA SZBK DNS - Chip Laborat órium szbk.hu/chiplab~

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript


  1. MTA SZBK DNS-Chip Laboratórium www.szbk.hu/chiplab~ A DNS CHIPEK ÉS ALKALMAZÁSUK SZE Bioinformatika 2003.10.09. DNA-chip Lab.BRC, Szeged

  2. Kromoszómák genetikai állomány hordozói sejt DNS Gének információ hordozók mRNS AAAAAA AAAAAA AAAAAA Fehérjék sejtfunkciók ellátása

  3. Néhány definíció „Genom, avagy a DNS birodalma”: egy szervezet teljes DNS készlete. „Transzkriptom, avagy a hírvivő RNS-ek birodalma”: egy sejten belüli, egy időpontban jelenlévő mRNS készlet. „Proteom, avagy a fehérje birodalom”: egy sejten belüli, egy időpontban jelenlévő fehérje készlet. cDNS=copy DNS, az érett mRNS DNS-sé átírt változata Oligonukleotid=néhány tíz nukleotidból álló DNS darab DNA-chip Lab.BRC, Szeged

  4. A genomprogram • Humán Genom Projekt és a Celera Genomics nevű biotechnológiai óriás 2000-ben együttesen jelentették be az emberi genetikai állomány kódjának közel teljes megfejtését. • 2001 februárjának közepén hozta nyilvánosságraeddigi eredményeit a világ két legrangosabb tudományos folyóiratában, a Nature, illetve a Science lapjain. • „Az emberiség 100,000 éves történelmének egyik legfontosabb napja, hiszen az emberek először olvashatják el saját könyvük betűit” Craig Venter, a Celera igazgatója DNA-chip Lab.BRC, Szeged

  5. Néhány érdekes adat az emberi genomról • Trillió sejt/szervezet • 3 milliárd betű/sejt • 2 méternyi DNS/sejt • 1betű/mp, 24 óra/nap 100év. • 1betű-mp, 16,5perc egy különbség. • 12 000 nukleotidothatároztak meg minden mp-ben Human Genome Project keretén belül • 3 mm-es távolságban összerakva 9000 km lenne, több mint 2x hosszabb mint a Mississippi • a korábbi feltételezésekkel (80-100ezer gén) ellentétben csak kb. 35ezer gén • a genomnak csak 1-1,5%-a kódoló, azaz exon szekvencia • egyenlőtlen géneloszlás-genetikai sivatagok • egyenlőtlen a kromoszómális eloszlás is (az XY kromoszómák sokkal kevesebb gén tartalmaznak mint pl. a 17 vagy 22-es kromoszóma • kb. 3millio SNP minden 1000 „beteg” • a rasszok jobban hasonlítanak egymásra a két nem DNA-chip Lab.BRC, Szeged

  6. szövet, szerv szint T G P T G P sejt szint A funkcionális molekuláris biológialényege 1. daganat képződés, gyulladás, különböző betegségek Minőségi és mennyiségi változások Környezeti hatások, gyógyszerek, fertőzések funkciók felderítése sejtosztódás, diffrenciáció, sejthalál

  7. A funkcionális molekuláris biológia és diagnosztika lényege (2) Eltérő állapotok molekuláris hátterének felderítése Trombosis, sclerosis DNS RNS fehérje metabolitok vizsgálata Összehasonlítás egészséges szövettel Segítség: adatbankok, szekvenálási projektek DNA-chip Lab.BRC, Szeged

  8. A funkcionális molekuláris biológialényege 3. P P P P P aktív gének vizsgálata AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA P P T Minőségi és mennyiségi változások követése Környezeti hatások, gyógyszerek, fertőzések T G G

  9. Az 1990-es években egy forradalmian új technika, fejlődött ki a gén és fehérje funkciók analízisére. Chip-technológia A biochipek nagyszámú (több ezer) cDNS, oligonukleotid vagy fehérjemolekula részletet tartalmazó kémiailag aktivált tárgylemezek A biochipek nagyszámú gén vagy fehérje együttes funkció analízisére alkalmasak DNA-chip Lab.BRC, Szeged

  10. A DNS-chip technolólgia komplementer nukleinsav-láncok hibridizációján alapul

  11. A. Examination of “transcriptome” B. Examination of “proteome” (generation of mRNA maps) (generation of protein maps) 1. Hybridization-based techniques - Northern blotting - RNase protection/S1-mapping - Subtraction cloning - DNA arrays 2. PCR-based techniques - Differential display - RDA (representational difference analysis) 3. Sequence-based techniques - ESTs (expressed sequence tags) - SAGE (serial analysis of gene expression) - DNA sequencing chip - Mass spectrometry sequencing Comparative molecular expression analysis - 2D gelelectrophoresis - MALDI-TOF mass spectrometry - combined electrophoretic and microsequencing techniques - “protein-chip” techniques DNA-chip Laboratory, BRC. Szeged

  12. DNS-chip technika Hibridizálás 100-20,000 Génspecifikus minta Radioaktív génspecifikus próba Dot-blot technika A pozitív RNS minták jelölődnek Hibridizáció Különböző sejtekből preparált teljes RNS-ek szilárd hordozóra kötve Teljes RNS jelölése Reverz dot-blot technika Pozitív génspecifikus minták jelölődnek Hibridizáció Génspecifikus minták rögzítése szilárd hordozóhoz DNA-chip Lab.BRC, Szeged

  13. nylon membránon néhány 100 • génspecifikus minta (DNS darab) • radioaktív jelölés • kis minta sűrűség • (100-1000 pont/cm2) macroarray • üveglemezen több • 1.000-10.000 génspecifikus minta • (DNS darab) • fluoreszcens jelölés • közepes mintasűrűség • (5000 pont/cm2) microarray • üveglemezen több • 10.000-100.000 génspecifikus • minta (DNS darab) • fluoreszcens jelölés • nagy minta sűrűség • (10.000pont/cm2) chip A chipek hordozó szerinti osztályozása

  14. nyomtatás Makroarray Chip Mikroarray Hibridizálás, fehérje-ellenanyag kölcsönhatás néhány 100, vagy több 1.000, 10.000 gén, fehérje jelölt minta X Egy chipkísérlet lépései cDNS klón és/vagy DNS szekvencia biológiai minta szövetből, sejtkultúrából mRNS, DNS, fehérje adatfeldolgozás, bioinformatika, génműködésre vonatkozó információk értékelése

  15. CHIPKÉSZÍTÉS cDNS alapú chip készítése Egyedi baktérium klónok izolálása kék/fehér szelekció Ismert és ismeretlen szekvenciájú cDNS darabokat tartalmazó klónok PCR amplifikáció 96 mintahelyes lemezeken cDNS könyvtár baktériumban PCR reakció ellenőrzése Tisztítás felcsepegtetés üveglemezekre Minden lemezen több 1000 ismert és ismeretlen szekvenciájú cDNS darab szerepel duplikátumban DNA-chip Lab.BRC, Szeged

  16. Microgrid ArrayerBioRobotics, UK DNA-chip Lab.BRC, Szeged

  17. Microgrid ArrayerBioRobotics, UK • 4, 16 tű • 84 lemez • 24 mikrotiter lemez (384) • Sebesség: 6400 pont < 4h. • Sűrűség: 20.000 pont/lemez DNA-chip Lab.BRC, Szeged

  18. Nyomtatótűa MicroArrayer robothoz DNA-chip Lab.BRC, Szeged

  19. Making microarrays by mechanical microspotting and ink jetting Touch surface Microarray Small volume is transferred to a solid surface by physical contact between the pin and the solid surface Sample is loaded into a spotting pin by capillary action After the first spotting cycle, the pin is washed and the next sample is loaded and deposited Move jets Deliver drop Wash, repeat Microarray An electrical current is used to expel a precise amount of liquid from the jet onto the surface Second sample is loaded and deposited to an adjacent address Sample is loaded into a miniature nozzle equipped with a piezoelectric fitting 1. Mechanical microspotting Move pins Wash, repeat Same sample can be transferred with the same pin to the next solid surface generating multiple arrays 2. Ink jetting DNA-chip Lab.BRC, Szeged

  20. Oligonukleotidalapú chip készítése 1. szintetikus oligonukleotidok kémiai kikötése

  21. CHIPKÉSZÍTÉS Oligonukleotidalapú chip készítése 2. in situ szintézis Affymetrix DNA-chip Lab.BRC, Szeged

  22. Multiplex in situ custom DNA synthesis • 1k and 10k features available Semi conductor Microarrays 1. Semiconductor Base 2. Scalable Density 3. Active Device - Computer Controlled Electro-Chemistry

  23. In situ MicroArray DNA Synthesis 5 4 1 60 Cycles 3 2

  24. In situ MicroArray DNA Synthesis 5 4 1 60 Cycles 3 2

  25. 1024 Features 13,416 Features 1K 10K Scalable Technology Platform

  26. Nagyobb DNS molekulák pl. PCR- felskszorozott cDNS klónok kovalens kikötése aktivált tárgylemezre DNA-chip Lab.BRC, Szeged

  27. mRNS T DNS-chipek Transzkriptom Mutációk, Egy nukleotid eltérések (SNP), deléció, inszerció Gén kifejeződés megváltozása AAAAA AAAAA Fehérjék AAAAA AAAAA P Proteom Kifejeződés, módosítások, kölcsönhatások G Genom Fehérje-chipek Mire alkalmasak a chipek? DNA-chip Lab.BRC, Szeged

  28. 1. SNP 3 pozíció 2. SNP 2 pozíció hibridizáció A G T C mosás A G T C Pontmutációk (SNP) detektálása • Oligonukleotid • alapú chipek • egy nukleotid eltérés • azonosítása Jelölt DNS DNS detektálás Adat analízis 1. SNP: 3. pozíció A-C 2. SNP: 2. pozíció C-T DNA-chip Lab.BRC, Szeged

  29. Jelölt cDNS hibridizáció mosás AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA mRNS detektálás biológiai anyag Génkifejeződés tanulmányozása – cDNS vagy oligonukleotid chip – transzkriptom analízise – aktív-inaktív gének detektálása – bonyolult adat és statisztikai analízis aktív gének vizsgálata • Adat analízis: • relatív aktivitás mérése • aszínesseljelölt • gének aktívak • afeketék nem DNA-chip Lab.BRC, Szeged

  30. Jelölt próba készítése: két különböző minta együttes analízise kontroll minta (egészséges, kezeletlen) sejt vagy szövet beteg, gyógyszerrel kezelt, különböző környezeti hatásoknak kitett sejt vagy szövet RNS tisztítás cDNS írás RNS-ből (reverz transzkripció) Cy5 dCTP Cy3 dCTP jelölt cDNS jelölt cDNS Hibridizáció, mosás Szkennelés DNA-chip Lab.BRC, Szeged

  31. RNS cDNS cDNS-chip 4000 különböző Arabidopsis génmintát tartalmaz cDNS-chipek alkalmazásai: (1) szövetspecifikus génexpresszió különbségek vizsgálata DNA-chip Lab.BRC, Szeged

  32. Gyógyszer-indukált génexpresszióváltozás vizsgálata Mycobacterium tuberculosis-ban cDNS-chip technikával 1. cDNS-chip készítése 2. RNS izolálás, és próbakészítés M. tuberculosis-ból Kezeletlen, kontroll baktériumok Isoniaziddal kezelt baktériumok RNS izoláció, jelölt cDNS készítése Cy3-dUTP és Cy5-dUTP felhasználásával Reverz transzkripció reakcióban. 3,834 ORF (össz. becsült ORF 97%-a) PCR génspecifikus primerekkel, tisztítás és felvitel poli-L-lizinnel bevont mikroszkóplemezekre robot segítségével 3. Hibridizáció EREDMÉNYEK: 4. Adatfeldolgozás - Isoniazid több olyan gént indukált, melyek a gyógyszerhatás mechanizmusával kapcsolatos fehérjéket kódolnak: II-es típusú zsírsavszintetázt, trehalóz dimikolil transzferázt. - további indukált gének: valószínűleg a gyógyszer toxikus hatásával magyarázható általános hatás miatt - egy új efflux proteint kódoló gén indukcióját is megfigyelték Az eredmények olyan információkat szolgáltathatnak, melyek gyógyszer hatásmechanizmusokat, új targeteket tárhatnak fel. PNAS (1999) 96, 12833-12838

  33. RNS cDNS cDNS-chip 6000 különböző egyedi egér génmintát tartalmaz cDNS-chipek alkalmazásai: (2) eltérő állapotokért felelős génexpresszió különbségek vizsgálata Új gének azonosítása Génfunkciók jellemzése Génkölcsönhatások megértése Differenciáció tanulmányozása Tumorképződés vizsgálata Gyógyszerek felfedezése DNA-chip Lab.BRC, Szeged

  34. Egészséges ésdagantos(HBL100 vs. breast carcinoma BT474) szövetek génkifejeződéseinek összehasonlítása DNA-chip Lab.BRC, Szeged

  35. Paraffinba ágyazott minták normál daganat Génátrendeződési arányok 9 4 Metasztázisok, tumorok, multiplex tumorok jellemzése, igazolása -1 DNS -6 PCR agy génarány Tüdő génarány -11 -16 12 q 03 q 12 p13 17 p13 08 p23 09 p13 11q23 17 p13 18 q21.3 19 p13.2 19 p13.2 19 q13.4 19 q13.4 21 q22.1 22 q13.1 01 q21 02 q13 06 q27 07 p21.3 09 q21.2 10 p11.2 13 q32.2 16 q23.1 19 q13.12 19 q13.43 20 q11.22 20 q13.33 01 p34.2 01 q21.1 01 q21.3 03 p21.3 04 p16.3 06 p21.3 01 p36.31 06 p21.31 03 p21.1-9 09 p12-13.3 14 q24-q31 09 q32-q33.3 01 p13-p21 01 q24-q25 01 q31-q32 02 p13-p12 02 q34-q35 01 p12-13.3 01 p33-34.2 01 q21.2-22 Xp11.3-p11.23 18 p11.1-q11.2 08 q21.2-q21.3 03 q21.1-q21.2 07 p15.3-7p14 Genomszintű változások, kromoszóma rendellenességek, amplifikációk, deléciók detektálása

  36. Képanalízis Lézer szkenner Cy5 Lézer szkenner Cy3 kontroll minta (egészséges, kezeletlen) sejt vagy szövet beteg, gyógyszerrel kezelt, különböző környezeti hatásoknak kitett sejt vagy szövet Cy3 dCTP Cy5 dCTP jelölt cDNS jelölt cDNS

  37. ? Nem szignifikáns adatok ADATFELDOLGOZÁS „Árnyékzóna”

  38. Cy-3, Cy-5 jelek kvantitatív összehasonlítása Quantarray szoftverrel (GSI Lumonics) Arány és intenzitás megszorítások nélkül Arány és intenzitás megszorításokkal DNA-chip Laboratory, BRC, Szeged

  39. DNS-chipek képanalízise

  40. Adatfeldolgozás, statisztikai analízis R1=(CH1I-CH1Bk)/(CH2I-CH2Bk) R1M=IF(CHB1<0.55,"",IF(CHB2<0.55,"",IF(FLAG=1,"",R1))) R1MN=IF(R1M="","",R1M/NoF) R1MNA=IF(R1MN="","",IF(R1MNx="","",IF(RMN1Rep>=RMN1x, IF(RMN1Rep/RMN1x<2,(RMN1x+RMN1x)/2,""),IF(RMN1x/RMN1Rep<2, (RMN1Rep+RMN1x)/2,""))))

  41. Slide 42

  42. Ábrázolási módszerek 1. normál arány Ratio Cy5/Cy3 Spot label

  43. Ábrázolási módszerek 2. log2 arány

  44. Leukémiák molekuláris osztályozása génexpresszió monitorozással DNS-chipek alkalmazásával - Új alosztályok felfedezése - Új esetek osztályozása - Jóslat kemoterápiás kezelés hatékonyságára - Atipikus esetek tisztázása Jövő: - Tumorminták gyűjtése - Kemoterápia jellemzése - Expressziós analízis - Adatbank létrehozása - Alosztályok meghatározása - Kemoterápiára adott válaszok jellemzése DNS-chipekkel - hatásmechanizmus feltárása - rezisztenciáért felelős gének azonosítása Science 1999, 286, 531.

  45. B-sejt limfómák osztályozása Alizadeh et al., Nature, 2000, 403, 503-511.

  46. Teszt és általános gének azonosítása: 1. beteg cDNS RNS CML hibridizálás cDNS 2. beteg RNS cDNS x. beteg RNS diagnózis kezelés korai reakció RNS RNS RNS RNS RNS RNS RNS RNS RNS RNS 1. típus tünetmentesség kontrol kontrol kontrol kontrol kontrol kontrol kontrol kontrol kontrol kontrol relapszus 2. típus 3. típus Mintaelőkészítés, csoportosítások terve krónikus mieloid leukémiák osztályozásához Későbbi kimenetel

  47. Génexpressziós klaszterek patkány fejlődése során The time of birth is marked by a vertical line a. Normalized gene-expression trajectories are shown grouped by waves that are determined by clustering. The graphs below show the average normalized expression pattern or wave over the nine time points for all of the genes in each cluster. b. Tree of all gene-expression pattern. c. Plots of all normalized time series, highlighted wave 3. DNA-chip Laboratory, BRC, Szeged

  48. Dataprocessing and visualization Sejtosztódást gátló, apoptózist serkentő vegyület hatásának vizsgálata 3 sejttenyészeten 2 különböző koncentrációban humán cDNS-chippel Repression of cell division Imaging: „tree” & „galaxis” clastering methods

More Related