生物工程学中新型的应用合成生物学的体外代谢途径

1. 生物工程学中新型的应用合成生物学的体外代谢途径生物工程学中新型的应用合成生物学的体外代谢途径 江南

2. 要点 • 摘要 • 简介 • 多酶系统组合 • 数据的产生 • 酶系统模型 • 网络的数学最优化 • 网络的实际最优化 • 结论

3. 摘要 • 大量的酶已经通过自身的进化能够在温和的温度和中性pH的水环境下行使功能。这在原则上使我们有独特的机会在体外构建一个具有相当催化复杂性的多步反应系统。但是，因为这种系统很难去组合,并富有成效的运作，所以它的应用很少能够超出研究的范围。目前在DNA合成、基因组工程学、高通量分析学、基于模型的生化系统的分析和（半-）合理性蛋白质工程学中的进展表明我们已经具有进行这种合理性设计和有效操作这种酶系统所需要的全部工具，并且最终能够获得它们进行初步合成的潜力。

4. 简介 • 在精细化工催化化学选择性、部位选择性和拮抗选择性等挑战性的反应中，生物转化已经成为了一种必不可少的工具，并且被典型性地用作一系列化学转化中的一种，所不同的步骤就是它们通常通过反应环境（温度、pH和溶剂）的剧烈变化来定性。但是，酶具有独特的优势，因为它们中的大多数已经被选择在水环境中进行操作。这至少在原则上允许我们同时对很多不同的酶进行操作，但也意味着需要处理更大的催化复杂性。当然，这种方法已经广泛应用于通过发酵来生产化学产品或药物，但是在药学中仍有大量另人感兴趣的分子因为不能跨膜、高毒性、比较低的终浓度和或产生，或共合成很多的副产品而很难通过发酵来生产。 • 通过生物转化而不是发酵生产的、多步化学合成的化合物的主要例子是来自单糖和寡糖组，并且多酶系统在这里已经被应用于很多情况。几种基于糖单元来构建的药物和疫苗已经得到，而且以后还会获得更多。

5. Figure1.Complex molecules and pathways as targets for synthetic biology. (a) Arixtra, (b) A premier example of the synthetic power of systems of enzymes (adapted from [9]): the formation of ketose-1-phosphate compounds from sucrose in an eight-enzyme system.

6. 但是，尽管有了很好的基于酶的系统，化学途径在工业中仍然是但是，尽管有了很好的基于酶的系统，化学途径在工业中仍然是 占主要位置的。目前酶系统在工业中很少应用的原因： 1.很难比较经济的组合一个酶系统 2.因为底物、中间物和产物与酶的相互作用使得这个系统的动态行为 很复杂，不好理解。此外，系统倾向于朝着细胞稳态，而不是提高生 产力所要求的非自然状态的方向发展 3.在实验中增进第二点的方法非常剧烈 尽管如此，这种多酶系统毕竟在大小和复杂性上被限制了（特别 是对于整个细胞系统），此外，我们收集酶系统的能力一直在加强 ，分析方法的使用范围和潜力也一直在扩大，因此我们至少能够半合 理性的设计酶的功能特性。最终，拥有合理设计所需要的全部条件。

7. Figure2. The engineering cycle for the rational design of systems of enzymes 多酶系统的组合 数据的产生 实际最优化 酶系统模型 数学最优化

8. 多酶系统的组合 • 在阐述多酶催化潜力的里程碑性质的论文中，Fessner和Walter组 合了8个酶来将蔗糖转化成几个可能的磷酸酮糖中的一种。 • 目前已经获得高度工程化株系，但是存在细胞背景干扰 消除干扰的方法： 1.靶基因相对于背景的过量表达 2.从宿主有机体中去除那些产生干扰基因产物的基因 3.期望的酶带上同一个标签序列 • 有利的进展 1.大DNA片段的非模板驱动—简化人造酶系统的多基因组合 2.宿主的整体最小化基因组库 —减少背景干扰

9. 数据的产生 建立机械模型,它的参数结合起来能够对观察到的特殊现象作出清楚正确的解释,并且这些参数随后能成为系统修饰的靶位点。 • 方法: 1.依靠纯化蛋白质的复杂研究 缺点：a.这种数据集只在少量的模型系统如糖酵解中完全得到了 b.动态参数通常是在一个人为的条件下被确定的,并且针对复杂的化学情形不能确定参数是怎样变化的 c.没有快速的方法去确定一个系统的酶量,这就使最大反应速率相当难解 2.从相当大的、准确的实验数据集中估计动态参数 （利用质谱定量记录代谢物集） 条件：a.快（亚秒内） b.需要一种有效的，高通量相容的数量分析

10. Figure 3.The main steps involved in quantitative MS-based analysis of intracellular metabolites and typical time ranges required for individual steps. Continuous direct injection has so far only been used for qualitative purposes, not quantitative, and requires MS/MS technology.

11. 酶系统模型 将实验数据浓缩到机械模型中。这个模型包括一组不同的方程和一 组用来说明不同反应速率的、含参数的非线性代数表达式，并且这些参 数必须在动态的浓度数据集的基础上被确定。 • 问题与解决方法 1.酶系统中的大量参数和方程系统的高度非线性本质使得数值很难估计—应用随机整体最优化程序（特别是进化策略）解决 。 2.对一个模型结构中误差的处理 —应用自动化产生包含相似模型的家族来支持最优化程序,或借助灰盒模型

12. 网络的数学优化 通常是通过对被估计的参数进行敏感性分析来估计为了增进相应酶的性能需要做什么样的变化。 • 方法 1.整个酶的水平要保持恒定，中间代谢物的变化需要保持平均较小的水平，随后结果的最优化问题用非线性最优化代数的方法解决 。 2.线性化一个相关状态周围的机制模型，然后用混合整数线性程序鉴定敲除的最优组合和在限制条件下对酶的调节 。

13. 网络的实际优化 模型的最优化应该能够清楚的表明在网络中什么酶的什么特性需要被修饰，例如酶浓度可以采用基因的过量表达来调节。 • 其它参数的调节主要采用两条路径： 1.进化策略 2.（半-）合理性设计：是一种利用芯片和体内方法的反复过程。目的是为了阐明一个蛋白质的序列-结构-功能的关系，并且通过计算工具来预测对特定氨基酸进行替代后的效应。

14. Figure 4.The kinetic properties of enzyme n as an element in a system of enzymes need to be adapted to increase the overall efficiency of the system. The example enzyme is uncompetitively inhibited by substrate n+2 .By using either directed evolution or a (semi-)rational approach that drastically limits the required number of mutants to screen, the required adaptation is implemented in an iterative approach.

15. 结论 • 我们认为上述讨论的工作表明设计有效的酶系统的合成生物学方法所需要的中枢元件已经或很快将被建立。但是，为了能够获得真正的成功，不同的元件（系统组合、分析、模型建立和操作）必须被看作一个整体：测量对系统干扰的动态反应能够估计模型的参数，因此能够进行模型分析，指导干扰点的鉴定，随后又能促进（半-）合理性酶操作，这个周期的完成在生物技术中将作为一个工程学方法的实例，并且作为合成生物学在精细化工中重要的例子。

16. 谢 谢!