1 / 20

Người hướng dẫn : 1.PGS.TS.Phan Hữu Tôn 2.KS.Tống Văn Hải

Đề cương thực tập tốt nghiệp Đề tài:   “ Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử DNA để chọn lọc gen tms2 tạo ra các dòng TGMS mới”. Người hướng dẫn : 1.PGS.TS.Phan Hữu Tôn 2.KS.Tống Văn Hải Bộ môn : Công nghệ sinh học ứng dụng

leilani-snyder
Download Presentation

Người hướng dẫn : 1.PGS.TS.Phan Hữu Tôn 2.KS.Tống Văn Hải

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Đề cương thực tập tốt nghiệpĐề tài:  “Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử DNA để chọn lọc gen tms2 tạo ra các dòng TGMS mới” Người hướng dẫn : 1.PGS.TS.Phan Hữu Tôn 2.KS.Tống Văn Hải Bộ môn : Công nghệ sinh học ứng dụng Khoa CNSH-Trường ĐHNN-Hà Nội Người thực hiện : SV.Nguyễn Thị Hồng Hạnh Lớp :06-02 CNSH

  2. Phần I :Mởđầu 1.1.Đặt vấn đề: • Cây lúa (Oryza sativa L.) là một trong ba cây lương thực chủ yếu trên thế giới(lúa mì,lúa gạo,ngô),có tầm quan trọng sống còn với hơn nửa dân số thế giới.Hiện nay với sự gia tăng dân số nhanh và sự giảm dần diện tích đất nông nghiệp đặc biệt là đất canh tác lúa mỗi năm thì vấn đề đảm bảo an ninh lương thực là yêu cầu cấp thiết cần quan tâm trước mắt cũng như lâu dài.Do đó,để tăng năng suất lúa gạo,một trong những hướng đặt ra có hiệu quả cao đó là sử dụng ưu thế lai.

  3. Cácgiốnglúalaihiện nay chocóthểchonăngsuấtcaohơn 20-30% so vớicácgiốnglúathường.Hiệnnay,chúngtađangsửdụnghaihệthống:hệthốnglúalaihaidòngvàhệthốnglúalaibadòng.Nhưnglúalaihaidòngvượttrộihơnhẳnnhư:cơhộichọntạocácdòngbốlớnthuậnlợichoviệccảitạochấtlượnggạo,khôngcóhiệuứngđồngtếbàochấtnênítbịsâuhạihơn,năngsuấtcaohơnlúalaibadòngtừ 5-10%,chỉ cầnhaidòngkhácnhauvềbảnchấtditruyền(mộtlàdòng TGMS hoặcPGMS,hailàdòngchophấn) nêngiáthànhgiảm,tínhtrạngbấtdụcđựcmẫncảmvớiđiềukiệnmôitrường(EGMS) chủyếu do mộtcặp gen lặnđiềukhiểnthuậnlợichoviệctạogiốngmới.

  4. Để chọn tạo lúa lai hai dòng thành công thì dòng TGMS phải nhiều và phong phú,từ đó mới tạo ra được tổ hợp cho ưu thế lai cao.Hiện nay các dòng TGMS đang được sử dụng như:103S,T1S-96,64S,287S,36S2,Kim 76S,Pair 64S và 25S. • Các nhà khoa học đã tìm được 6 gen TGMS(tms1, tms2, tms3, tms4, tms5, tms6).Mỗi gen này có ngưỡng chuyển hóa hữu dục và bất dục khác nhau,trong đó,gen tms2 có ngưỡng chuyển hóa hữu dục ổn định.Nhà chọn tạo giống đã sử dụng các gen TGMS này lai chuyển vào các dòng,giống lúa triển vọng để tạo dòng TGMS tốt,có khả năng phối hợp cao,tạo ra nhiều tổ hợp lai mới cho ưu thế lai cao như TH3-3,Việt Lai 20,TH3-4,…

  5. Bằng việc sử dụng ADN marker(chỉ thị phân tử) thời gian chọn tạo ra các dòng mới được rút ngắn.Các chỉ thị liên kết chặt với các tính trạng kiểu hình.Do đó,chúng ta có thể xác định được các tính trạng dựa trên sự có mặt của các gen mong muốn.Kỹ thuật này không chỉ có độ chính xác cao mà còn xác định được trên một lượng lớn vật liệu nghiên cứu. • Để đáp ứng được mục tiêu chọn giống chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử DNA chọn lọc gen tms2 để tạo ra các dòng TGMS mới”.

  6. 1.2.Mục đích và yêu cầu: • 1.2.1.Mục đích: -Xác định gen tms2 trong tập đoàn các dòng TGMS bằng chỉ thị phân tử. -Nghiên cứu di truyền gen tms2. • 1.2.2 Yêu cầu : -Khảo sát một số đặc điểm nông sinh học của các tổ hợp lai F1 -Chiết tách AND để tiến hành phản ứng PCR -Đánh giá được khả năng hữu – bất dục bằng phương pháp truyền thống của các tổ hợp lai F2. -Phát hiện gen tms2 ở các dòng TGMS và thế hệ F2.

  7. Phần II : Tổngquantàiliệu 2.1. Hiện tượng ưu thế lai 2.2. Hệ thống lúa lai hai dòng - Khái niệm hệ thống lúa lai hai dòng - Ưu điểm của hệ thống lúa lai hai dòng - Các phương pháp chọn tạo dòng mẹ lúa lai hai dòng(EGMS). + Phương pháp truyền thống + Chỉ thị phân tử và ứng dụng 2.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo lúa lai hai dòng - Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trên thế giới - Tình hình nghiên cứu và ứng dụng ở Việt Nam

  8. Phần III : Vậtliệuvàphươngphápnghiêncứu 3.1. Đốitượng , vậtliệu , địađiểmvàthờigiannghiêncứu  3.1.1. Đốitượngnghiêncứu Gồmmộtsốtổhợplai F1­­­ , quầnthể F2 3.1.2. Vậtliệunghiêncứu * Thínghiệmtrongphòng: • Thiếtbị :+ Máy PCR , máychạyđiệndi , máychụpảnhđiệndi , máylitâm , máyvotex , tủlạnh , lò vi sóng . + Cácloạiốngeffendof , cácloạipipetvàđầutiếpđikèm . • Thànhphầnchophảnứng PCR + Cặpmồipháthiện gen bấtdụcđực tms2 theoM.T.Lopezvàcộngsự (2003)cótrìnhtựlà : RM11_F:5’-TCTCCTCTTCCCCCGATC-3’ RM11_R:5’-ATAGCGGGCGAGCTTAG-3’ • Hóachấtchạy PCR :dNTD , MgCl2 , Taq ADN polymerase , PCR mastermix , nướccất • Hóachấtdùngđểchiếttách ADN hệ gen :

  9. Thành phần dung dịch đệm chiết tách • Ngoài ra còn có : • Hỗn hợp Phenol : Chlorofom : Isoamylalcohol ( 25:24:1 ) • Ethanol 70% • Đá lạnh • Dung dịch đệm TE

  10. Thành phần dung dịch đệm TE • Hóa chất dùng cho chạy điện di trên Gel agarose : Agarose 1% , Ethidium Bromide 10mg/ml, loading Bufer(Bromo phenol blue , Xylen cyanol , Saccarose ) • * Thí nghiệm ngoài đồng ruộng: • Gồm 1 vài tổ hợp lai F1­­­ giữa dòng mẹ TGMS là 103S với các dòng bố khác • Cọc tre, nilon, thước.

  11. 3.1.3. Địa điểm nghiên cứu:tại phòng công nghệ sinh học ứng dụng và khu thí nghiệm đồng ruộng khoa nông học – Trường Đại Học Nông Nghiệp Hà Nội .  3.1.4. Thời gian nghiên cứu : Đề tài được thực hiện từ tháng 1/2010 đến tháng 5/2010.

  12. 3.2. Nội dung vàphươngphápnghiêncứu * Nội dung nghiêncứu +) Theo dõiđặcđiểmnôngsinhhọc : • Cácchỉtiêunôngsinhhọc : + Thờigiantừcấyđếnbắtđầutrổ(10% sốbôngthoátkhỏiláđòng). + Thờigiantrổtừkhibắtđầutrỗ(10% sốbôngthoátkhỏiláđòng) đếnkhikếtthúctrổ (85% thoátkhỏiláđòng) . + Thờigiantựcấyđếnchín(85% sốhạtchắcmàuvàng) + Tổngthờigiansinhtrưởngtừgieođếnkhithuhoạch . + Chiềucaocây (cm) cuốicùng : đotừmặtđấtđếnmútđầubôngdàinhấtkhôngkểrâu . + Chiềudàiláđòng : đotừgốiláđếnđầumútlá , đovàogiaiđoạnchínsáp. + Chiềurộngláđòng. + Gócđộláđòng . + Chiềudàibông : đotừcổbôngđếnhếtbôngvàothờikìchínchắc .

  13. Chỉ tiêu các yếu tổ cấu thành năng suất: + Tổng số nhánh(số nhánh max) + Số nhánh hữu hiệu /khóm : đến toàn bộ số nhánh trổ thành bông . + Tổng số hạt/bông. + Số hạt chắc/bông + Khối lượng 1000 hạt . + Số bông hữu hiệu/khóm: đến toàn bộ số bông có từ 10 hạt chắc trở lên + Năng suất lý thuyết được tính theo công thức : NSLT = A x B x C x mật độ/đơn vị diện tích(g) Trong đó: A: số bông hữu hiệu/khóm B: số hạt chắc/bông C: khối lượng 1000 hạt

  14. Ưuthếlaicủacáctổhợplai so vớibốmẹ : Ưuthếlaitrungbình H(MP%) = MP (mit parent) làgiátrịtrungbìnhcủahaibốmẹ . ƯTL trungbìnhlàsựbiểuhiệnhơnhẳn ở mộttínhtrạngnàođó ở con lai F1 so vớigiátrịtrungbìnhdó ở haibốmẹ. Ưuthếlaithực H(BP%) = BP(best parent) làbốhoặcmẹtốtnhất . Ưuthếlạithựclàbiểuhiệnsựhơnhẳnn ở mộttínhtrạngnàođócủa con lai F1 so vớigiátrịđócủabốhoặcmẹtốtnhất. • Nghiêncứuchỉthịphântửnhằmxácđịnhđược gen tms2 cótrongcácdòng TGMS , cáctổhợp F2.

  15. 3.2.2. Phươngphápnghiêncứu * Xácđịnhkhảnăngchứa gen bấtdụcđựcmẫncảmvớinhiệtđộ tms2 bằngphươngpháp PCR : +) Chiếttách ADN tổngsốcủadòngmẹTGMS,cáctổhợpphânly F2theoquytrìnhcảitiếncủaBộmônCôngnghệsinhhọc. • Bước 1:Thu ngắtmẫulákhỏe,dàikhoảng 2cm bỏvàoốngeppendorfcó dung tích 1,5ml,đánh dấutêngiốngrồibỏvàođálạnh. • Bước 2:Cối,chày sứdùngđểnghiềnmẫuđãđượchấpkhửtrùngvàđặttrongđálạnh.Cácmẫuláđượccắtnhỏkhoảng 0,5cm rồibỏvàocối. • Bước 3:Nhỏ 400 µl dung dịchđệmchiếtsuất ADN vàocốirồinghiềnnhỏmẫuláchođếnkhi dung dịchchuyển sang màuxanhđen. • Bước 4:Bổ sung thêm 400 µl dung dịchchiếtsuất AND vàophatrộnlẫnsauđóhút 400 µlvàoốngeppendorfđãđượcđánhdấu. • Bước 5: Cho 700 µlhỗnhợp Phenol : Chlorofom : Isoamylalcohol ( 25:24:1 )

  16. Bước 6:Cho 600 µlhỗnhợpChlorofom : Isoamylalcohol(24:1),lắcđềuvalytâm 7 phútvớitốcđộ 13000 vòng/phútrồihútphần dung dịch ở trênvàoốngeppendorfmớiđãđánhdấutươngứng. • Bước 7: Cho 800 µl Ethanol(96%)(hoặc 600 µlIsopropanol),trộnđềuvàlytâm 7 phútvớitốcđộ 13000 vòng/phút.Sauđóđổphần dung dịchphíatrêngiữlạiphầnkếttủadướiđáyốngnghiệm. • Bước 8: Rửakếttủabằng Ethanol 70%,làm khôtựnhiên ở nhiệtđộphòngbằngcáchúpngượcốngnghiệmlêngiấythấm. • Bước 9:Hòa tan kếttủabằng 50 µl dung dịch TE rồibảoquản ở nhiệtđộ -20oC +Kiểmtrađộtinhsạch ADN bằngcáchđiệnditrên gel agarose 1%. +Tiếnhànhphảnứng PCR vớicặpmồi RM11 cho gen tms2.

  17. Thành phần cho phản ứng PCR

  18. Chu trình nhiệt PCR cho cặp mồi tms2 Chạy điện di phát hiện sản phẩm PCR trên gel agarose 1 %

  19. *Nghiêncứuưuthếlaicủacáctổhợplai F1 so vớibố +Bốtríthínghiệm: -Thínghiệmđượcbốtrítheophươngphápkhảosáttậpđoàn,các con lai F1trồngcạnhbốtươngứng.Cáctổhợplaiđượcbốtrítuầntựkhôngnhắclại. -Ô thínghiệmđượcbốtrítheohìnhchữnhật,mỗi ô là 5m2. +Cácbiệnphápkỹthuật: -Làmđấtcàybừa -Thờivụ: Vụchiêmxuân 2010 -Ngàygieomạ :01/2010 -Ngàycấy: 02/2010 -Cấy 1 dảnh/khóm,cây x cây 11cm,hàng x hàng 20cm. -Mậtđọcấy 45 khóm/m2. -Lượngphânbóncho 1 ha: Phânđạm 120 kg Phânlân 90kg Phân kali 60kg +Kỹthuậtbónphân: -Bón lót:100%lân + 30%đạm,bón saukhibừa. -Bónthúclần 1:50% phânđạm +40% phânkali,bónvàothờikìbắtđầuđẻnhánh. -Bónthúclần 2:bón hếtsốđạm,kalicònlại,bónkhilúalàmđòng.

  20. PhầnIV:Dựkiếnkếhoạchvàkếtquảđạtđược 4.1.Kế hoạch: -01/2010,viết đề cương và bảo vệ đề cương -Gieo mạ:06/01/2010 -Cấy: 10/02/2010 -Từ 21/02/2010 khảo sát các đặc điểm nông sinh học,tiến hành phản ứng PCR và viết báo cáo tốt nghiệp. 4.2.Kết quả: -Phát hiện được tổ hợp chứa gen tms2 -Tìm được marker-PCR liên quan đến tính trạng nghiên cứu

More Related