1 / 28

Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 10 . RAPD, ISSR apod.

Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 10 . RAPD, ISSR apod. Petr Koutecký & Jiří Košnar, 201 3. Vytvořeno v rámci projektu Molekularizace biologických oborů PřF JU reg. č. CZ.1.07/2.2.00/15.0364. RAPD – princip.

lerato
Download Presentation

Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 10 . RAPD, ISSR apod.

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript


  1. Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 10. RAPD, ISSR apod. Petr Koutecký & Jiří Košnar, 2013 Vytvořeno v rámci projektu Molekularizace biologických oborů PřF JU reg. č. CZ.1.07/2.2.00/15.0364

  2. RAPD – princip • Random amplified polymorphic DNA (Williams et al. 1990) • Hledáme polymorfismus DNA pomocí PCR reakce s1 arbitrárním primerem • Sekvenci primeru volíme „náhodně“: • obvykle dekanukleotid • počet různých dekanukleotidů: 410 = 1048576 • volí se primery se zvýšeným (60-70%) obsahem GC → stabilnější vazba při PCR (annealing, extenze při 72°C) • V praxi se sekvence primerů „naslepo“ zkouší: • test většího počtu primerů • výběr těch, které dávají vhodné banding pattern (dost variability a zároveň jednoznačné vyhodnocení výsledků)

  3. nic (orientace) nic (moc daleko) RAPD – princip • PCR reakce proběhne, pokud: • jsou přítomny komplementární sekvence k primerům na protilehlých vláknech DNA • jsou dostatečně blízko u sebe • separace fragmentů elektroforézou na základě délky • jsou vzorce na výpočet očekávaného počtu proužků (např. Williams et al. 1993), ale nefungují

  4. http://pgrc3.agr.ca/ RAPD gel • agarosa (horizontální) nebo polyakrylamid (vertikální) • barvení EtBr, SYBR green, GelRed apod. • ideálně po proběhnutí ELFO, post-staining (minimalizace deformací a posunů proužků) • vyhodnocení: přítomnost / nepřítomnost proužku • dominantní data (0 / 1)

  5. kodominantní RAPD – vznik varibility • Mutace v místě nasedání primerů (zánik / vznik místa) většinou detekovatelný jen kratší produkt • Inzerce / delece v amplifikovaném úseku • Inverze apod.

  6. RAPD – metodické problémy • Metoda velmi citlivá na reakční podmínky PCR • koncentrace a čistota DNA • koncentrace primerů, Mg2+, polymerasy, složení pufru,… • konkrétní průběh teploty (rychlost zahřívání,…) → nutno používat stejný cykler • Relativně nízká teplota annealingu (35-45°C) • mismatched priming = amplifikace i z míst, kde primery nesedají zcela přesně (mírně odlišná sekvence) • zásadních ± 8 nukleotidů na (3’ konci), zbytek nemusí nasedat přesně • zejména u kratších fragmentů mohou vznikat stabilní smyčky z daného vlákna DNA (konce mají komplementární sekvenci!) → horší amplifikace

  7. RAPD – metodické problémy • Neznámá genetická podstata proužků • nejistá homologie • dominance (nepoznáme heterozygoty), ale ne vždy • až 5% kodominatních proužků (Williams et al. 1990) • neznámá dědičnost (nukleární vs. organelové) • biperentální vs. uniparentální • kompetice primerů apod. • ve směsi DNA dvou různých organismů se neamplifikují proužky z obou stejně (pokud se mírně liší sekvence v místech nasedání primeru) • mohou vznikat heteroduplexy (2 různě dlouhá vlákna) → jiná mobilita při elfo • může nastat v genomu hybridů, allopolyploidů,… • nespecifičnost – amplifikuje jakoukoliv DNA • endofytické houby, epifytické řasy,…

  8. RAPD - standardizace • vyhodnocujeme jako dominantní data (0 / 1) • intenzita proužků se neuvažuje • mohou být heterozygoti, ale nemusí • obecně slabé produkty se neuvažují • raději méně spolehlivých znaků nežvíce, ale nespolehlivých • krátké fragmenty (< 100 bp) se většinou neuvažují • zvyšuje se nejistota homologie • podobně i u příliš dlouhých fragmentů • 1700 bp je na agarose téměř nerozlišitelné od 2000 bp • všechny analýzy provádět stejně a na stejném cykleru • všechny vzorky 2× (včetně extrakce!) • uvažují se jen pozice, kde jsou opakování shodná

  9. Výhody není nutná znalost genomu (univerzální metoda) relativně málo DNA jednoduchost a rychlost cena fragmenty (teoreticky) rozmístěny po celém genomu velké množství (~ desítky až stovky) polymorfních fr. RAPD – srovnání s jinými metodami Nevýhody • citlivost na reakční podmínky, nesrovnatelnost mezi laboratořemi → někteří recenzenti zamítají publikace založené na RAPD... • dominantní data • nejistá homologie fragmentů atd. • neznámá dědičnost fragmentů

  10. nic (orientace) nic (moc daleko) flanking sequence CACACACACACACACACA flanking sequence ISSR • Inter-simple sequnce repeats (Zietkiewicz 1994) • podobný princip jako RAPD • jako primery slouží mikrosatelitové sekvence • mikrosatelit (= simple sequence repeat, SSR) je jeden z typů repetitivních sekvencí - několikanásobné opakování krátkého (2-6 bp) sekvenčního motivu za sebou • amplifikují se úseky mezi dvěma mikrosatelity stejné sekvence a opačné orientace

  11. ISSR • menší citlivost na reakční podmínky než RAPD • primery delší (cca 18-20 bazí) než u RAPD • vyšší teplota annealingu (~45-60°C) → přesnější amplifikace (menší intenzita mismatched priming) • primery zahrnující několik bazí flanking sequence = anchored(„ukotvené“, např. GAGAGAGAGAGAGAGAYC) vs. unanchored (GAGAGAGAGAGAGAGA) • anchored primers neamplifikují vždy („selektivní báze“) • někdy používán touch-down postup • vyšší teplota annealingu v prvních cyklech PCR → specifičtější amplifikace, i když menší výtěžek • v dalších cyklech nižší teplota → vyšší výtěžek, specifita zajištěna předešlými cykly

  12. ISSR - gely • separace fragmentů na gelu (agarosa n. polyakrylamid); finální analýza: • dlouhé gely (aspoň ~40x40 cm); agarosa 1-1.5% w/v, 80V přes noc • post-staining

  13. ISSR - gely • separace fragmentů na gelu (agarosa n. polyakrylamid); finální analýza: všechny vzorky 2x KOR KAR BAL KEP SAF RYL SKA SKR 49 T 47 48 25 26 50 52 T 53 T 111 113 T 114 T 123 124 125 131 132 159 160 164 12 13 24 11 112 Carex, Jan Košnar 1st run

  14. ISSR - gely • separace fragmentů na gelu (agarosa n. polyakrylamid); finální analýza: všechny vzorky 2x KOR KAR BAL KEP SAF RYL SKA SKR 49 T 47 48 12 13 24 25 26 50 52 T 53 T 111 113 T 114 T 123 124 125 131 132 159 160 164 11 112 Carex, Jan Košnar 2nd run

  15. ISSR – fragmentační analýza • separace fragmentů v sekvenátoru → fragmentační analýza • fluorescenčně značené primery • pozn.: optimalizace – značený a neznačený primer stejné sekvence se může lišit v požadavcích na jednotlivé parametry PCR • separace fragmentů kapilární elekroforézou v sekvenátoru • vzorky nemigrují v čase lineárně, proto přidáván velikostní standard (směs fragmentů DNA o známé délce) • možnost kombinovat několik primerů značených různou barvou • v naší laboratoři až 4 barvy (6FAM, VIC, NED, PET) + 5 barva size standard (LIZ)

  16. ISSR – fragmentační analýza Centaurea, J. Karásek & P. Koutecký

  17. ISSR – srovnání s jinými metodami • jako RAPD, ale spolehlivější, méně citlivé na reakční podmínky Výhody • není nutná znalost genomu (univerzální metoda) • relativně málo DNA • jednoduchost a rychlost • cena • fragmenty (teoreticky) rozmístěny po celém genomu • velké množství (~ desítky až stovky) polymorfních fr. Nevýhody • dominantní data • nejistá homologie a neznámá dědičnost fragmentů • somatické mutace (nadhodnocují diverzitu) • do jisté míry citlivost na reakční podmínky, nepřenositelnost pro jiné studie, nutnost optimalizace primerů

  18. Další podobné metody • DNA amplification fingerprinting (DAF) • velmi krátké primery (5 nukleotidů) • různé teploty annealingu (vysoké i nízké) • Arbitrarily primed PCR (AP-PCR) • delší primery (≥ 20 nukleotidů) • na začátku několik cyklů s nízkou t annealingu (mismatch), následně cykly s vysokou t annealingu (přesná amplifikace) • Sequence-characterised amplified regions (SCAR) • osekvenování vybraných RAPD proužků (vyříznutí, klonování) • specifické primery (≥ 20 nukleotidů) komplementární ke koncům • primery jsou specifické pro daný lokus – lze rozlišit i kodominantní varianty • delší primery = vysoká reprodukovatelnost

  19. Další podobné metody • random amplified microsatellite polymorphism (RAMP) • kombinace 5‘-anchored ISSR primeru a RAPD primeru • složité PCR cykly (primery mají různé teploty annealingu –střídání v různých cyklech) • ISSR primer značený (fluorescenčně n. radioaktivně) → produkty amplifikované obou stran RAPD primerem nejsou vidět • … a mnoho dalších metod využívajících jako primery: • specifické sekvence různých typů transpozonů • kombinace retrotranspozonů a mikrosatelitů • kombinace s restrikčním štěpením fragmentů

  20. ISSR - aplikace • populační genetika (diverzita, fragmentace,…) • ochranářská • invazní • klonální a prostorová struktura populací • hybridizace • rozmnožovací systémy • taxonomie (vymezení a podobnost taxonů,…) • (fylogeografie) • (mezidruhové vztahy, fylogeneze)

  21. www.primulaworld.com Populační a ochranářská genetika Crema et al. 2009, Plant Syst. Evol. 280: 29–36 • Primula apennina, endemit • 6 populací „v řadě“, 9 primerů / 164 lokusů • relativně velká variabilita – He,, Shanon. index(sexuál, hetorostylie, daleko létající opylovač) • souvislost s pozicí populací (nejmíň na kraji,nejvíce v prostřední populaci) • tři genetické skupiny (BAPS), zřetelný tok mezi populacemi • potvrzeno i Mante-lovým testem(mírná pozitivní korelace)

  22. Taxonomie Jiménez et al. 2009, Folia Geobot. 44: 145-158 • Narcissus sect. Pseudonarcissi, Španělsko • spousta „podezřelých“ endemických druhů • 6 primerů – 89 lokusů + ITS sekvence • PCoA, NJ strom, (+ parsimonie pro ITS) • 3 výrazné skupiny v PCoA • nesoulad s morfologií • některé druhy nelze rozlišit • podpořeno také ITS • návrh revize taxonomie (spojení některých druhů)

  23. Hybridizace Ducarme et al. 2010, Folia Geobot. 45: 387-405 • Rhinanthus minor, R. angustifolius • test 100 RAPD a 100 ISSR primerů, výběr 8 druhově specifických lokusů (4 pro každý druh) • hybridní index: čisté druhy -4 a 4, F1 hybrid má 0, zpětní kříženci něco mezi • 2 přírodní populace + 1 umělá • vznik hybridů v umělé populaci • většina zpětných kříženců k Rh. angustifoliusvysvětlováno chováním opylovačů a většíautogamie u Rh. minor • drobné meziroční fluktuace

  24. Hybridizace Lo 2010, J. Evol. Biol. 23: 2249–2261 • mangrove rodu Rhizophora, 3 základní druhy a 3 předpokládaní hybridi (morfologie, neklíčivost semen) • 12 ISSR primerů (+ITS, cpDNA) • privátní alely zákl. druhů; hybridi 0, ale celkově víc alel (součet rodičů) • STRUCTURE identifikuje vždyhybrida (směs)i jeho rodiče • NewHybrids: všechno F1 hybridi • každá lokalita svůj ISSR genotyp →opakovaný vznik hybridů • ITS, cpDNA: ukazuje naobousměrnou hybridizaci jedna z lokalit, 3 druhy + hybrid

  25. Rozmnožovací systémy Han et al. 2009, Plant Syst. Evol. 277: 13–20 • Lotos nucifera v Číně • sběr semen (9-20) z 20 rostlin + dospělé rostliny, 10 populací • 5 / 12 primerů (28 / 173 lokusů) • porovnání potomstva a mateřský r.v programu MLTR • velká míra cizoprášení (>90%) • skoro žádný inbreeding (f ~ 0) • mírná autokorelace (podobné zdroje pylu u blízkých mateřských rostlin) + obvyklá studie populací (AMOVA, Mantel test,…)

  26. Identifikace klonů Gross et al. 2012, Ann. Bot. 109: 331–342 • Klonální struktura sterilních i fertilních popu-lací Greivillea rhizomatosa (Proteaceae) • Simpsonův index, gene diversity, modelypříbuznosti jedinců • 4 ISSR primery / 120 lokusů • velká klonální diverzita (>90%) i u sterilních populací (→ minulost) • somatické mutace ! 10 ze 42 ramet spojených pod zemí mělojiný genotyp • podle modelů 17-48% genotypů(v různých populacích) mohlo vzniknout somat. mutacemi [pozor, jiný druh]

  27. Prostorové závisloti (něco jako fylogeografie) Belluci et al. 2011, Plant Biol. 13: 381-390 • Tripodion tetraphyllum (= Anthyllistetraphylla) v sev. Africe • sucho, včetně intenzivních pastvin • 36 lokalit Maroko-Tunisko, z každésemena, z nich ale jen 2-3 kytky (celk. 94) • 5 ISSR primerů / 32 lokusů (+ cpSSR + 1 morfol. znak) • zřetelně klesající variabilita od západu k východu • 2 extrémní genotypy (STRUCTURE) na okrajích gradientu západ-východ, plynulý přechod (klinální variabilita) • relativně velké rozdíly mezi „populacemi“ (autogamie) • zřetelné autokorelace na škále <400 km • asi migrace od záp. k východu a selekce ve prospěch určitého genotypu na V okraji gradientu

  28. Prostorová struktura populace Matesanz et al. 2011, J. Ecol . 99: 838-848 • společná populace Thymus vulgaris (hojný)+ Th. loscosii (endemit) na ploše 10 m2 • prostorové rozmístění jedinců v 1m2 plochách + faktory prostředí (vlhkost, půda, pokryvnost,…) • genetická variabilita (5 ISSR primerů pro druh) • obecně shlukovité rozmístění obou druhů a negativní vztah mezi nimi • u Th. vulgaris žádné klony, u Th. loscosii79 genotypů ze 100) • korelace mezi genetickou podobností Th. loscosii a abundancí Th. vulgaris – asi selekce genotypů Th. loscosii specializova-ných na určitou míru kompetice Th. vulgaris

More Related