第九章 植物原生质体的分离、培养和融合 第一节 概述 一、概念 原生质体就是除去了细胞壁的裸露的球形细胞。 植物细胞与动物细胞不同，在细胞膜外有一层坚硬的纤维素组成的细胞壁。

1. 第九章 植物原生质体的分离、培养和融合 第一节 概述 一、概念 原生质体就是除去了细胞壁的裸露的球形细胞。 植物细胞与动物细胞不同，在细胞膜外有一层坚硬的纤维素组成的细胞壁。 由于这层细胞壁的存在，阻碍了细胞融合的发生和遗传物质的跨膜传递。 原生质体具有一切活细胞的特性，同时具有许多细胞完整细胞不具备的特点。这些特点和植物细胞全能性结合起来，使植物原生质体在遗传工程和体细胞遗传学中开辟了一个理论和应用研究的崭新领域。

2. 二、植物原生质体是体细胞遗传学研究的重要实验系统二、植物原生质体是体细胞遗传学研究的重要实验系统 1、去除了细胞壁，使它能容易地摄取外来遗传物质，如DNA，染色体、病毒、细胞器等，为细胞水平和分子水平的遗传操作提供了实验系统。 2、植物原生质体可以自发地或被诱导产生细胞融合，为体细胞杂交提供了实验材料。 3、植物原生质体也具有细胞的全能性，为植物诱变育种提供了实验材料。 4、利用植物的原生质体可以非常容易地分离各种细胞器，用于各种遗传操作。 5、研究细胞膜的功能（信息传递、能量转换、物质运输等） 所以，植物原生质体是体细胞遗传学研究的重要实验系统，正在越来越为研究者所重视。

3. 第二节 植物原生质体的分离 一、原生质体的分离方法 1、细胞壁的组成： 纤维素、半纤维素、果胶质和少量的蛋白。 2、技术关键： 去除细胞壁，又不损伤原生质体。 3、分离方法 A：机械法分离： 利用高渗的糖液，使细胞发生质壁分离，然后利用利刃切割。 机械分离法的适宜的材料：高度液泡化的细胞（组织）。

4. 机械分离法的限制： ①得到的原生质体有限。 ②只限于能够广泛发生质壁分离的组织。 ③不能从成熟的和分生细胞分离原生质体。 B：酶解法分离： 1960年，英国的Cocking首先利用纤维素酶制备了番茄的原生质体，证实了利用酶解法制备大量原生质体的可能性。 直到1968年在纤维素酶和离析酶投入市场化生产后，原生质体的研究才成为一个热门领域。

5. 酶解法的优点： ①能够容易地大量地得到原生质体 ②条件温和，完整性好，有活力。 ③几乎可以从任何组织（只要细胞还没有木质化）分离出原生质体。 现在为常规方法。 二、酶解法的材料来源 1、叶肉细胞 取材方便，供应及时，细胞排列疏松，易于酶解液的处理，有叶绿素标记。 温室生长的植物，叶片干净幼嫩，是较好的材料来源。 无菌苗的叶片更具优势。

6. 2、悬浮培养的细胞或愈伤组织 由禾本科的植物叶片获得适于培养的原生质体是相当困难的，可以利用培养细胞制备原生质体。 有些悬浮培养的细胞，细胞壁难以用目前的酶制剂降解，可以在培养基中加入生长素、含硫氨基酸、还原剂或重金属离子培养细胞，有时可以改变细胞壁的组成。 生长素对细胞壁的可塑性和延长是一个重要的影响因子，含硫氨基酸和还原剂可以影响细胞壁的双硫键，对细胞壁的降解有利。 经常进行继代培养的细胞、或培养基中蔗糖浓度较低的悬浮培养细胞，分离原生质体时的得率高，细胞碎片少。

7. 三、原生质体的分离步骤 （一）取材（叶肉细胞） 充分展开的嫩叶。 洗涤、消毒、无菌水冲洗。 对禾本科植物叶片消毒时，使用苄烷铵（Zephiran）（0.1%） - 酒精（10%）溶液漂洗5分钟效果最好。 （二）酶解 原生质体分离的情况在很大程度上取决于所用酶的性质和浓度。 纤维素酶主要分解细胞壁纤维素。 果胶酶（非常好离析酶）主要降解细胞壁间的中胶层。 有些组织在制备原生质体时，可能还会需要半纤维素酶。

8. 酶解液的组成 • 酶的混合液： • 纤维素酶（1-2% 浓度）、果胶酶（0.2- 0.5%浓度）等。 • 渗透稳定剂： • 促进酶解，保持原生质体的完整性。 • 甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等， 适宜的浓度为450-800 m mol/L。 • 盐类 • 氯化钙 50 -100m mol/l，磷酸二氢钾(0.7m mol/l)等。 • 增加膜的透性。 • 以盐类调节培养基的渗透压对原生质体往往是有害的。

9. 酶解 • 材料→ 撕掉下表皮→ -修剪成2cm见方小块 → 置于6cm直径培养皿中(下表面朝下0.5g) → 加2ml酶解液→置于25-27°C下保持3-4小时左右--轻轻震荡—原生质体释出。 • 3、影响酶活性和酶解效果的因素 • 纯度：纯化的酶活性可能降低 • PH值：4.7-6.0之间 • 温度：酶活性的最适温度40-50℃，植物所需温度为25-30 ℃ • 时间：30分钟-20小时 • 用量：1g鲜组织用10ml酶解液的效果很好。

10. 刚游离出来的叶肉原生质体

11. 四、原生质体的纯化 酶解后的混合物中将含有完整的原生质体、亚细胞碎屑（叶绿体、维管成分）、未被消化的细胞等，因而必须将这些杂质除去。 初步筛选：利用50-70µm孔径的镍丝网过滤混合物，收集滤出液，做进一步的纯化。 1、沉降法： 将上述滤出液置于离心管中，在70g-100g下离心2-3分钟，原生质体将沉于管底，细胞碎屑浮于上清液中。 弃上清，冲洗液冲洗，50g下离心3-5分钟。 冲洗液CPW的配方为(mg/L)： KH2PO4 27.2 KI 0.16 KNO3 101.0 CuSO4.5H2O 0.025 CaCl2.2H2O 1480.0 （PH5.7）。 MgSO4.7H2O 246.0 (Cocking和Peberdy,1974)。

12. 2、漂浮法： 利用比重大于原生质体的高渗蔗糖溶液做离心液，将经过镍网初筛的过滤液置于蔗糖溶液的顶部，在100g下离心10分钟，离心后，碎屑沉淀，纯净的原生质体将出现在蔗糖溶液和原生质体冲洗液的界面上。 利用移液管将原生质体吸出，转移到另一个离心管中，用冲洗液冲洗3次。 离心液的蔗糖浓度为20-21%。 3、梯度离心法 A：6%的聚蔗糖和9%的聚蔗糖（溶于其他盐类和7%山梨醇中），组成梯度离心液，经150g离心5分钟。细胞残片留于管底，原生质体上浮。

13. B：400g5分钟离心，在蔗糖层之上出现纯净的原生质体层，碎屑在管底。B：400g5分钟离心，在蔗糖层之上出现纯净的原生质体层，碎屑在管底。 原生质体悬浮液， 300mmol/L山梨醇+ 100mmol/LCaCl2 140mmol/L蔗糖+ 140mmol/L山梨醇 500mmol/L蔗糖

14. 第三节 植物原生质体培养 一、原生质体的培养基 1、基础培养基： KM8p（Kao，Michayluk，1975），成分复杂，有机物增加。 高浓度的甘露醇（0.5-0.7 mol/l）和山梨醇。 2、激素： 禾本科植物，2、4-D的效果就很好。 烟草：NAA优于2、4-D和IAA。 旺盛生长的悬浮培养细胞：生长素/细胞分裂素，比值高。 高度分化的叶肉细胞：生长素/细胞分裂素，比值低。需要较高浓度的细胞分裂素，原生质体才可能恢复分裂。 没有普遍适用的培养基

15. 二、原生质体的培养方法 （一）液体培养法 优点：培养方便，利于补充新鲜培养基，利于培养物的转移和分离。 1、液体浅层培养 将原生质体悬浮于液体培养基中，在培养皿或培养瓶中培养，液层厚度1mm。 2、液体小滴法培养 将原生质体悬浮于液体培养基中，用吸管吸取原生质体的悬浮液，滴于6cm直径的培养皿中培养，液滴大小在 0.1-0.2ml左右 。

16. 3、微悬滴法培养 将原生质体悬浮于液体培养基中，用微量移液管吸取原生质体的悬浮液，滴于6cm直径的培养皿的盖上，液滴大小 20-50µl左右，悬滴培养。 为了防止培养基迅速蒸发，可以在培养基的底皿里加液体培养基保湿。 原生质体在液滴的中央生长。

17. （二）固体平板培养 优点：原生质体的位置固定不变，为定点跟踪观察原生质体的发育过程提供了方便。

18. （三）双层培养 在培养皿的底部为固体培养基，在固体培养基上滴加原生质体悬浮液。 优点：固体培养基能够不断地补充液体培养基中的营养，液体培养基不易干枯。

19. （四）饲养层培养 是一种低密度培养原生质体的培养方法。 饲养细胞的制备： 利用5103R的X-射线原生质体，这一照射剂量能够抑制细胞的分裂，但并不破坏细胞的代谢活性。 该原生质体悬浮密度一般为106细胞/ml，照射后应及时冲洗原生质体2-3次，除去有毒物质。 将上述原生质体植板（接种）在软琼脂培养基上，植板密度为正常原生质体培养时的植板密度（ 104 ~ 1105个/ml）。 饲养细胞的来源：同种植物或异种植物的悬浮培养细胞或原生质体。 靶原生质体（目的原生质体）接种在饲养细胞之上，植板密度可以下降到10-100个原生质体。

20. 三、影响原生质体培养的因素 （一）原生质体活力测定 1、目测（显微镜镜检） 纯化后原生质体收缩，生活状态的原生质体可以吸水膨胀。 2、FDA（荧光素双醋酸酯） 生活状态的原生质体可以吸收FDA，在脂酶的作用下释放荧光素，在荧光显微镜下发射荧光。 （二）培养时的密度 初始的原生质体的植板密度对植板率有很大的影响。 原生质体的植板密度影响原生质体与培养基的营养扩散平衡。 植板密度一般为5103 ~1105个/ml。

21. （三）培养基 KM8p能使原生质体的培养密度下降到10个/ml。 KM8p培养基营养丰富。 （四）光照 最初两周暗培养； 分化时补充光照培养（KM8p在强光下对植物有毒）。 （五）温度 随培养物的种类而不同。 与母体植株相似。

22. 四、原生质体的发育和植物再生 1、细胞壁的再生和分裂 培养一旦开始，细胞壁就开始合成，矮牵牛在1-2天内形成细胞壁，然后开始细胞分裂。 蚕豆培养细胞制备的原生质体，在培养开始20分钟时就开始细胞壁的合成，在72小时之后，完成细胞壁的合成。 原生质体失去特有的球形外观，视为细胞壁再生的象征。 只有先再生出细胞壁，才能进行正常的细胞分裂。 2、愈伤组织及胚状体的形成 3、植株再生 豆科、禾本科植物再生困难。

24. 第四节 植物原生质体融合 诱导不同来源的原生质体发生原生质体融合，是获得体细胞杂种的唯一途径 一、体细胞杂种植物 1、科间（融合）杂种 融合产物可以进行细胞分裂，但亲本之一的染色体会选择性地消失。 2、属间（融合）杂种 前景诱人：马铃薯番茄→产生了开花结实的融合体、但不育。 3、种间和种内体细胞融合 可以容易地获得可育的后代

25. 4、体细胞融合中的不对称杂种 只带有一个亲本的染色体和另一个亲本的部分染色体或基因的融合后代。 是体细胞融合的主要产物之一 二、融合的方法和技术 原生质体可以自发地发生融合，但融合频率极低，在体细胞杂交中没有意义。 在体细胞杂交中，通常都是采用物理的和化学的方法人工诱导产生融合

26. （一）化学诱导融合的方法和机制 1、硝酸钠融合法 Carlson等（1972）利用这种方法产生了第一个体细胞杂种。 融合的频率低、异核体的频率低、诱导融合的NaNO3浓度对原生质体有毒害。 2、高钙高pH值法 Keller和Melchers（1973）利用强碱性（pH10.5）的高浓度钙离子（50mmol/LCaCl2.2H2O）溶液在37℃，处理30分钟诱导了两个烟草品系叶肉细胞的原生质体发生了融合。 融合容易，但对于有些原生质体体系来说，如此高的pH值也许是有害的。

27. 高钙高pH法诱导融合的试验程序 1、将选种的两个亲本的原生质体1:1混合，调整密度为2.5×105原生质体/ml。 2、在50g下离心3~5分钟，使原生质体沉淀。 3、去上清，加入2ml促融液，其中含50mmol/L甘氨酸-NaOH缓冲液， 50mmol/LCaCl2.2H2O 以及400mmol/L甘露醇，pH值10.5。 4、在50g下离心3~5分钟，使原生质体沉淀。 5、把离心管置于37℃水浴中10~30分钟。 6、用清洗介质（600mmol/L甘露醇，50mmol/LCaCl2.2H2O） 置换掉促融液，放置30分钟。 7、用清洗介质洗涤2次。 8、将原生质体悬浮在液体培养基中进行微滴培养。

28. 3、聚乙二醇（PEG）法 是目前原生质体融合的主流技术 聚乙二醇分子式为HOCH2（CH2-O-CH2）nCH2OH，水溶性 优点：融合频率高，异核体频率高，重复性强，毒性低，产生的融合没有特异性，可以使动物-动物、动物-植物的原生质体发生融合。 对融合效果的影响因子： PEG浓度：25-30% PEG的分子量：1500-6000 钙离子浓度：50m mol/l， 作用时间：15-30分钟 原生质体的浓度：4~5%的原生质体的悬浮液（原生质体的容积/液体容积）。

29. （二）电融合法 采用电击仪进行诱导融合。 融合在融合小室内进行。 在两个电极板间的原生质体发生极化，进而象念珠一样排列起来。 若施以脉冲放电，则可以使原生质体发生质膜的可逆性击穿，从而使相邻的2~3个原生质体发生融合 不同的材料发生融合所需的条件不同，不好掌握。设备昂贵。 化学诱导即可以满足原生质体融合的要求。

30. 三、原生质体的融合产物 同核体（同源多倍体） 、异核体、 在膜融合之后的数小时之后，2个融合的原生质体的细胞质混合在一起，形成一个双核的异核体。 在亲缘关系较近使，两个原生质体的细胞核有可能发生同步的有丝分裂，这时，二者的染色体可能被一个共同的纺锤体所牵引，从而形成一个核融合的异核体。 由于双亲的细胞周期不一致，可以导致亲之一的染色体选择性的丢失。 例如：大豆×粉蓝烟草的体细胞杂种。在融合后的第一次细胞分裂中就可以发现异常的染色体，1个月后，粉蓝烟草的大染色体已经很少能见到，7个月后粉蓝烟草的大染色体基本上选择性地消失。

31. 原生质体融合过程示意图 A 2个彼此独立的原生质体；B 2个原生质体间发生凝聚作用 C、D 在局部位置上膜融合 E、F 形成1个球形异核体

32. B A 异核体 射线照射 B 射线照射 A 胞质杂种 体细胞杂种

33. 细胞质杂种： 在有性杂交中，细胞质只能来自于母本。 在体细胞杂交（原生质体融合）时，杂种却可以同时拥有双亲的细胞质基因组。 利用原生质体融合技术，使两种来源不同的核外遗传成分（细胞器）与一个特定的核基因组结合在一起，这种杂种就称为细胞质杂种。 当质体和其他一些可能的细胞器的消失与双亲之一的核基因的消失（或从一开始就不存在）同时发生时，将会出现各种可能的核、质组合。 体细胞杂种细胞系的这个特征，现在被用来在种内和种间转移细胞质雄性不育性。

34. 四、杂种细胞的筛选 融合后的混合产物中有亲本的原生质体、同核体、异核体，应加以选择，筛选出杂种细胞。 （一）互补法筛选 利用2个亲本对培养基、抗代谢物、或温度等的敏感性存在着天然的互补性进行选择叫互补法选择。也可以利用隐性基因的互补性进行选择。 1、激素自养型筛选 粉蓝烟草和郎氏烟草的野生型叶肉细胞原生质体是激素异养型细胞，且原生质体不分裂；杂种细胞是激素自养型细胞，且在没有激素的培养基上可以旺盛分裂。使融合产物在不含激素的培养基上培养，能够产生细胞团的就是融合的原生质体。

35. 1、两步法激素自养型筛选

36. 2、营养缺陷型突变互补 硝酸还原酶的蛋白突变体和辅因子突变体，突变体不能利用硝态氮，只能利用铵态氮。 两者的突变位点不同，原生质体融合后，硝酸还原酶恢复，可以利用硝态氮。

37. 3、利用对抗代谢物质的敏感性互补进行筛选 Petunia hybrida 矮牵牛 Petunia parodii 矮牵牛 在 MS 培养基中只形成很小的细胞团，不能进行生长 在 MS 培养基中可以形成肉眼可见的愈伤组织团 加入1µg/L放线菌素-D，原生质体的分裂不受影响 加入1µg/L放线菌素-D，原生质体完全不能分裂 原生质体融合 在加入1µg/L放线菌素-D的培养基中培养，能够进行生长的愈伤组织即为体细胞杂种

38. （二）机械法筛选 方便，不用对培养物的生理性状有许多的了解，适用范围广。 1、根据可见标志选择 利用叶肉细胞和培养细胞原生质体的天然色泽标记进行选择。 在低密度培养条件下可以实现。 油菜叶肉细胞的原生质体与拟南芥的培养细胞的原生质体融合，培养3-5天后，在显微镜下用微吸管将融合产物（4-8个细胞的细胞团）转移，进行微室培养。

39. 2、利用荧光标记物标记进行选择 在形态上无法区分的原生质体，可以采用该方法进行选择。 硫氰酸荧光素发绿色荧光，碱性蕊香红荧光素发红色荧光，利用这两种荧光染料分别对不同的原生质体染色，诱导原生质体融合后，在显微镜下镜检，发两种荧光的即为杂种细胞。 也可以利用电子分拣技术进行分拣，速度快（5103个细胞/秒）。 荧光标记并不影响原生质体的再生。

41. 五、体细胞杂种植株的鉴定 如果原生质体融合得到的细胞杂种，其所具有的染色体数目恰巧为双亲染色体数目之和，我们称这种细胞杂种为双二倍体。 实际上，融合产物中真正的双二倍体并不多见，往往都会出现染色体数目的不正常现象。 染色体数目不正常的原因：1、质核互作，2、 两个以上的原生质体发生了融合。 1、形态学 是否具有双亲植株的形态学性状，例如马铃薯番茄的植株具有双亲的形态。 2、细胞学 对杂种植株进行核型分析。 3、分子生物学 对杂种植株进行DNA分子杂交，验证是否有外源 DNA 的导入。

42. 六、通过原生质体摄入细胞器、微生物和DNA进行细胞的遗传操作六、通过原生质体摄入细胞器、微生物和DNA进行细胞的遗传操作 （一）叶绿体的移植 利用PEG（聚乙二醇）处理，可以使原生质体与叶绿体发生融合，叶绿体进入原生质体。 叶绿体不稳定，制备后要立即使用。叶绿体有双层膜结构，在与原生质体发生融合时，叶绿体自行融合的双层膜与原生质体的质膜发生又发生了融合，使叶绿体遭到不可逆的结构破坏，叶绿体无法分裂（复制）。 将每毫升含 106 个原生质体（胡萝卜）与108 个叶绿体（刺松藻）的培养液用 28% PEG 4000 在 28℃ 下处理 10 分钟，然后逐步稀释，将有45%的原生质体中含有叶绿体。

43. （二）核移植 利用PEG融合法，原生质体可以将游离的细胞核摄入。导入率可以达到0.5-5%。 利用这种方法，已经将矮牵牛的细胞核导入矮牵牛、烟草和玉米。 Binding（1976）使用这种方法，将矮牵牛的细胞核导入烟草后，在再生植株中没有发现矮牵牛的染色体 （三）微生物的移植 人们企图建立一种微生物与高等植物细胞的内共生关系，以便最终得到一种新的非豆科固氮植物。 研究者一直试图把固氮菌和蓝绿藻之类的微生物引入原生质体。 利用PEG法处理原生质体和微生物的混合物，可以使原生质体摄入根瘤菌、酵母细胞和蓝绿藻等，但这些微生物在被摄入之后的情况，人们还一无所知。

44. （四）外源DNA的摄入 通过把 DNA 导入细胞而进行高等植物的遗传转化，是一个高度复杂的过程，它涉及到外源DNA的摄入和在受体细胞的异种环境中的整合、复制、表达和传递。 DNA 进入原生质体后，会发生降解，降解的产物又被重新利用，这是遗传转化的一个难题。 利用质粒的环状 DNA 将外源 DNA 保护起来，构成一个分子载体，将外源 DNA 导入原生质体。 根癌农杆菌的Ti质粒就是一个比较理想双子叶植物的表达载体。