实验三

实验三 MTT比色法检测小鼠脾脏NK细胞活性

（MTT比色法检测小鼠脾脏NK细胞活性） 原理： • 1、制备小鼠脾细胞（含NK细胞） • 2、NK细胞与肿瘤细胞（ YAC-1 ）共孵育，NK活性越强，肿瘤细胞被杀死越多。 • 3、MTT底物可被活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶还原成蓝紫色产物，死细胞无此功能；活细胞越多，颜色越深；据此推断活细胞或死细胞的多少。 • 4、经酶标仪比色后，可计算出NK细胞活性。

主要方法： • （一）免疫细胞（小鼠脾NK细胞）的制备 • （二）NK细胞活性测定（MTT比色法）

MTT比色法检测小鼠脾脏NK细胞活性 [方法]： • 1、靶细胞制备 YAC-1细胞，洗涤，计数，调整至2×105/ml （已制备好，用前摇匀） • 2、效应细胞（脾NK细胞）制备处死小鼠，消毒取脾，制成脾细胞悬液，过滤，离心洗涤，计数，调整细胞浓度至2×106/ml。（具体操作如下）

2、效应细胞（脾NK细胞）制备 • （1）脱颈椎处死小鼠，放入中号平皿； • （2）酒精棉球消毒，无菌取出脾脏，放入小平皿； • （3）脾脏用Hanks液冲洗一次； • （4）轻轻拉碎脾脏，并悬浮于约3ml Hanks液中；稍倾斜静置5分钟，使大块组织沉降； • （5）吸上清过120目或200目滤网，滤液滤入试管； • （6）滤液1500转/min离心5min，倒去上清；

（7）脾细胞沉淀用Hanks液洗2次（加入3ml Hanks液，混匀，1500r/min，离心5min，倒去上清；重复上述步骤1次）； • （8）用1ml 1640培养液溶解脾细胞沉淀，混匀，配成脾细胞悬液（原液），计数（吸取20ul加入780ul白细胞稀释液中，稀释40倍，用血球计数板在显微镜下计数，根据P53页公式计算脾细胞悬液原液中脾细胞浓度）； • （9）吸取一定量脾细胞悬液原液，用1640培养液配制2×106/ml浓度的脾细胞悬液1毫升至2毫升，待用。 • 3、细胞毒试验按表7-3加样，

4、孵育 二氧化碳培养箱孵育2小时；加MTT，继续孵育2小时。 • 5、测OD值轻轻吸弃上清，加二甲亚砜150ul ，振荡5min，测OD值。 • 6、结果分析

表7-3 MTT法测NK细胞活性试验各组成分(3复孔/组) NK细胞活性（%）= 实验组OD值 - 效应细胞对照组OD值（1- ）×100% 靶细胞对照组OD值

NK细胞活性（%）= 实验组OD值 - 效应细胞对照组OD值（1- ）×100% 靶细胞对照组OD值

附：P53细胞计数公式： 细胞浓度（细胞数/ml原液）= 4大格内的细胞总数 ×10000×稀释倍数 4

A C B D

实验三

实验三

Presentation Transcript