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1. 课程网址 http://e-learning.bjmu.edu.cn/bin/index.pl

2. 构型(configuration)和构象(conformation) • Configuration：The geometrical arrangement in polymers arising from the order of atoms determined by chemical bonds. • Conformation：The geometrical arrangement in polymers arising from rotation about adjacent carbon-carbon single bonds. • 构型的改变，分子中一定会有共价键的断裂和新的共价键的生成；而构象的改变不需要共价键的变换

3. 构型异构体还是构象异构体？ Isotactic Syndiotactic

4. 构型异构体还是构象异构体？

5. Techniques in receptor research 尹长城 北京大学医学部生物物理学系

6. 3. 受体与配基结合的动力学

7. 3.1 受体放射配基结合分析 • 60年代初在受体研究中采用放射性标记核素 并建立了受体放射配基结合分析 (radioligand binding assay, RBA)，它的理论基础是占领学说 • 该理论认为 • 受体与配基以单分子相互结合(分子比为1:1) • 反应服从质量作用定律, 反应是可逆的 • 配基在结合和解离后不被代谢，也不与其它类型受体结合 • 受体与配基结合后产生的生物效应的强度与受体被占领的量成正比

8. 3.1 单位点受体与配基结合反应的数学表达 • 受体与配基结合作用的反应式如下: • 根据质量作用定律，结合反应速率为 v1= k1[R][L], 解离反应速率为 v2= k2[RL] • 当反应达到平衡时, v1= v2，所以 • （1） • [R]、[L]、[RL]分别为游离受体、游离配基、受体-配基复合物的摩尔浓度 • k1、k2分别是结合速率常数、解离速率常数 • Kd是解离平衡常数，单位为mol/L; Kd值的大小作为衡量配基与受体相互结合能力的一个重要物理量: Kd值愈小结合能力愈大; Kd又称为亲和常数 k 1 [ R ] + [ L ] [ R L ] k 2

9. 3.1 单位点受体与配基结合反应的数学表达 • 设：[RT]为受体的初始浓度 • （2） • 重排并整理得： • （3） • 上式即Scatchard方程 ，以[RL]/[L]为纵轴，以[RL]为横轴作图得一直线 • 直线斜率为-1/Kd, 横轴截距为[RT], 纵轴截距为[RT]/Kd

10. Scatchard图

11. 3.1 单位点受体与配基结合反应的数学表达 • 同理可推出： • （4） • 上式为Woolf方程：以[L]/[RL]为纵轴，以[L]为横轴作图得一直线 • 直线的斜率为1/[RT], 横轴截距为-1/Kd, 纵轴截距为Kd/[RT]

12. Woolf图

13. 3.1 单位点受体与配基结合反应的数学表达 • 同理还可推出： • （5） • 上式为Lineweaver-Burk方程，亦称双倒数方程：以1/[RL]为纵轴，以1/[L]为横轴作图得一直线 • 直线的斜率为Kd/[RT], 横轴截距为–1/Kd, 纵轴截距为1/[RT]

14. Lineweaver-Burk图

15. 3.1 单位点受体与配基结合反应的数学表达 • 设：[LT]是总配基浓度, [L] = [LT] – [RL], 将 [L] = [LT] – [RL] 和 [R] = [RT] – [RL]代入(2)式，经整理得： • （6） • 上式为以[RL]为变量的双曲线一元二次方程 • 当[RT]、Kd固定时，[RL]随[LT]的变化而变化，开始上升很快，以后逐渐趋向水平，这就是饱和曲线

16. 受体与配基结合曲线 • SB为特异性结合，NSB为非特异性结合，TB为总结合 • [SB]= [TB] – [NSB]

17. 3.1 单位点受体与配基结合反应的数学表达 • 将(1)式重排变成下式： • （7） • 设[RL] = ½[RT], [L]=[L]1/2, 带入上式，得 • 整理，得 Kd = [L]1/2 • 结论：在50％受体结合配基时,体系中游离配基的浓度就是受体的解离平衡常数Kd值

18. 3.2 双位点系统 • 一种配基可以和两种受体结合，这两种受体往往是某类受体的两种亚型 • 选用某种放射配基，进行饱和实验，用Scatchard 作图法得到的不是直线而是向上凹的曲线；这条曲线是由高低亲和性不同的两条直线加合成的

19. 双位点系统 Scatchard曲线 饱和曲线

20. 双位点系统 • 近年来发展了很多方法用来进行双位点系统受体亚型的研究 • 用选择性放射配基进行多点饱和实验 • 用非选择性放射配基和选择性非放射配基进行竞争性取代实验 • 原则上它们也可以用于多种亚型的分析，但是由于配基选择性的限制及实验误差的存在等原因, 多数成功的例子仅限于双位点系统

21. 3.2.1选择性放射配基的饱和曲线 • 选择性放射配基，对一种亚型有高亲和力, 而对另一种亚型则为低亲和力 • 多点饱和实验显示，随着[LT]加大，[RL]先是因高亲和力的大部分结合趋向饱和，然后由于低亲和力亚型结合增多，曲线又住上翘 • 用Scatchard作图得到的不是直线而是向上凹的曲线，也就是说，随着[LT]增加，曲线前部分斜率很陡 (高亲和力亚型结合)，然后斜率平坦 (低亲和力亚型结合)

22. 3.2.1选择性放射配基的饱和曲线 • 应该指出，即使[LT]很小时，低亲和力亚型也不是完全不结合，所以不能把饱和曲线或Scatchard 曲线截然分成两段，前一段是高亲和力亚型结合，后一段是低亲和力亚型结合。实际上每段曲线都是两种亚型结构的总和，只是每种亚型所占比率多少不等而言 • 在实际分析数据工作中，首先需用合理的受体结合反应的数学模型，然后是运用计算机程序处理，才能得到两种亚型受体的[RT]和Kd值

23. 双位点饱和实验法 • 运用Scatchard方程分两种受体亚型，由于系统中放射配基L是相同的, 它们各自的结合方程为 • 实际上，实验中测量得到的是[RL],而不是[RL1]和[RL2],由于[RL]=[RL1]+[RL2],所以 • （8） • 上式中[RL],[L]是实测值,[RL1]、[RL2]、Kd1、Kd2为四个待测参数。只要有足够多的实验点，就可以用最小二乘回归法去求四个参数，并根据参数再拟合成两种亚型的图形

24. 3.2.2 非选择性放射配基和选择性非放射配基竞争结合 • 选用放射配基对两种亚型受体的亲和力相同，选用非放射配基对一种亚型有高的亲和力，对另一种亚型则是低亲和力 • 在一定浓度的放射配基和受体系统中加入不同浓度的选择性非放射配基作竞争结合反应。高亲和力的配基容易与受体结合而取代放射配基，表现为部分结合位点在低浓度竞争剂即明显丧失放射性，而另一部分受体在高浓度竞争剂时对放射配基有明显抑制作用 • 和双位点饱和曲线一样，这种区分不是绝对的。必须通过计算机拟合才能得到两种亚型的各自参数

25. 3.2.2 非选择性放射配基和选择性非放射配基竞争结合 • 如果只有一种亚型受体系统，放射配基和选择性非放射配基(抑制剂)与受体反应，则 • 体系中[R]是共同的，解上述联立方程，得： • 如果体系中有两种亚型受体，则 • （9）

26. 3.2.3 正负协同作用 • 何谓正负协同作用？它是指当一部分受体与配基结合后使相邻的受体的亲和力发生改变的现象 • 亲和力下降称之为负协同作用；亲和力增大称之为正协同作用 • 在Scatchard图中，曲线斜率变小为负协同作用；曲线斜率变大为正协同作用

27. Scatchard图与正负协同作用

28. Hill方程与正负协同作用 • 用Hill作图法可判别协同作用的性质。其原理如下： 倘若一个受体可以和n个配基结合，并且Kd值相同, 则 • 移项，得 • 两边取对数，得 • （10）

29. Hill方程与正负协同作用 • 以 为纵坐标，lg[L]为横坐标作图： • 直线的斜率为n，称为Hill系数

30. Hill系数与正负协同作用 • 令 , 则 • 由于kd值不变，如果： • n=1, [L]1/2 = Kd , 简单单位点系统 • n<1, [L]1/2 > Kd , 体系中游离配基，受体亲和力，负协同作用 • n>1, [L]1/2 < Kd , 体系中游离配基，受体亲和力，正协同作用

31. 3.2.4 反应速率常数的测定 • 测定受体-配基反应的速率常数是研究受体反应动力学性质的一种研究方法 • 反应速率常数有结合速率常数k1和解离速率常数k2 • 反应达到平衡时其k2/k1的值就是Kd，即平衡解离常数。用此法测得的Kd值与饱和实验所得的Kd值在理论上是一致的

32. 结合速率常数 • 根据质量作用定律:v1 = k1[R][L], v2 = k2[RL] • 复合物[RL]生成的速率为 • （11） • 设受体总浓度为[RT]，配基总浓度为[LT], 则 • 设 [LT]>>[RT],在反应过程中[LT]变化很小，则 • （12） k 1 [ R ] + [ L ] [ R L ] k 2

33. 结合速率常数 • 当反应达到平衡时，d[RL]/dt = 0，设此时复合物的浓度为[RLe] ,则 • （13） • 将（13）式带入（12）式，得 • 整理，得 • （14）

34. 结合速率常数 • （14）式积分，得 • （15） • （13）式整理，得 • （16） • 将（16）式带入（15）式，得 • （17） • 令k表=k2+k1[LT] 为表观速率常数(复合物净生成速率常数)，则 • （18）

35. 解离速率常数 • 当受体与配基的结合反应达到平衡时，加入大于100倍量的非标记配基，使标记配基与受体不再结合而且平衡破坏，受体－标记配基复合物发生解离，其速率为 • （19） • 重排，得 • （20）

36. 解离速率常数 • （20）式积分，得 • （21a) • 或 • (21b) • 当[RL]= ½[RLe]时, t=T1/2（复合物解离一半的时间） • 所以 • （22）

37. 受体-放射配基反应复合物时相曲线 t=0 ½[RLe] T1/2

38. 速率常数测定 • 根据(B)曲线求复合物解离一半所需时间即T1/2，由（22）式求出k2 • 根据(A)曲线不同时间测得[RL]，以ln{[RL]/[RLe–RL]}为纵坐标，t为横坐标作图，图中直线斜率由(18)式知其为k表值 • 由k表=k2+k1[LT]，便可求得k1值

39. 3.2.5 受体的竞争性和非竞争性结合反应 • 在一个受体和放射配基的反应系统中加入另一个化合物，它若能和受体结合,则会抑制放射配基与受体的结合反应 • 加入的化合物称为受体反应的抑制剂,抑制剂可以是激动剂，也可以是拮抗剂 • 拮抗剂按其作用机制又可分为竞争性拮抗剂和非竞争性的拮抗剂

40. 3.2.5 受体的竞争性和非竞争性结合反应 • 竞争性拮抗剂的抑制作用是它与激动剂竞争受体的相同或邻近的部位，竞争性拮抗剂与激动剂对受体结合作用是相互排斥，竞争性拮抗剂与受体结合只减少激动剂与受体的结合数量 • 竞争性拮抗剂与受体结合后，不改变受体分子的结构,受体仍可与激动剂继续结合,而且可完全排除竞争性拮抗剂，表现出可逆反应的特性 • 非竞争性拮抗剂与受体结合后, 则改变受体分子的结构，激动剂不能排除拮抗剂，表现为不可逆反应特性 • 对拮抗剂竞争类型的鉴别是十分重要的, 鉴别的方法通常用双倒数作图法, 或Scatchard 作图法

41. 受体的竞争性和非竞争性结合反应 R + L RL Kd + + I I Ki Ki RI RLI 竞争性 Competitive inhibition 非竞争性 Noncompetitive inhibition

42. 竞争性拮抗的数学表达 (a) (b) (c) 将b,c带入a, 得 重排，得

43. 竞争性拮抗剂双倒数图 • 图中的I0是抑制剂浓度为零,I1是拮抗剂浓度为[I1] • 直线的斜率为 • 横轴截距为 • 纵轴截距为1/[RT] • 竞争性拮抗剂的特点是随拮抗剂浓度的增加受体的结合位点数不变,而亲和性变小 1/[RT]

44. 竞争性拮抗剂的Ki值 • 拮抗剂Ki值称拮抗剂的抑制常数,或称拮抗剂的解离平衡常数 • 有竞争性抑制剂存在的平衡常数Kd表称为表观解离平衡常数, Kd表与Kd的关系如下: • 所以 • （23） • Ki值是表征拮抗剂与受体结合能力的物理常数,不受实验条件而变化

45. 非竞争性拮抗的数学表达 重排，得

46. 非竞争性拮抗剂双倒数图 • 直线的斜率为 • 横轴截距为 • 纵轴截距为 • 如果Ki=Ki’, 则随拮抗剂浓度的增加受体的亲和性不变,而受体的结合位点数变小

47. 非竞争性拮抗剂的Ki值 • 拮抗剂浓度[I1]时,双倒数图曲线的斜率为 • 拮抗剂浓度[I0]时,双倒数图曲线的斜率为 • 所以 • （24）

48. 拮抗剂的IC50值 • 表征拮抗剂抑制作用强弱的另一个常用指标是IC50值(或称I50), IC50定义为抑制50％受体结合反应时所用抑制剂的浓度 • IC50值大，表明拮抗剂抑制作用小，但它不是特征常数，随实验所用的RT，放射配基含量不同而变化,不同抑制剂只能在同批实验条件下可作比较 • IC50值只表明拮抗剂抑制作用大小,它不能指出抑制剂是属于什么性质的抑制作用

49. IC50值求解的实验方法

50. IC50与Ki的关系 • 对竞争性抑制而言，结合放射配基的表达式为 • （25） • [I]=0时， • [I]=[I50]时， • 即 • 整理，得 • （26）