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子学习情境 1.3 干扰素发酵

子学习情境 1.3 干扰素发酵. 发 酵 制 药. 基因工程菌株 Pseudomonas putida VG84[pVG3] 工程菌株应该具备假单胞杆菌 宿主细胞的特征和生产于扰素的能力。基因工程菌的特性如下： 1 、宿主细胞假单胞杆菌特性 (1) 细胞形态。革兰阴性，可运动，有荚膜，无芽抱，杆状，长度为 3 ～ 5µm 。 (2) 菌落特征。在 LB 琼脂培养基上， 30℃ 培养 24h ，其菌落直径为 2.5 ～ 3.Omm ， 灰绿色半透明状。菌落之间结构相同，具有黏稠性。 2 、生化特性

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子学习情境 1.3 干扰素发酵

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Presentation Transcript

  1. 子学习情境1.3 干扰素发酵 发 酵 制 药

  2. 基因工程菌株Pseudomonas putida VG84[pVG3]工程菌株应该具备假单胞杆菌 • 宿主细胞的特征和生产于扰素的能力。基因工程菌的特性如下： • 1、宿主细胞假单胞杆菌特性 • (1)细胞形态。革兰阴性，可运动，有荚膜，无芽抱，杆状，长度为3～5µm。 • (2)菌落特征。在LB琼脂培养基上，30℃培养24h，其菌落直径为2.5～3.Omm， • 灰绿色半透明状。菌落之间结构相同，具有黏稠性。 • 2、生化特性 • 不能将明胶、淀粉、聚-β-羟丁酸液化为可溶性单糖，不能利用反硝化作用进行厌氧呼吸，能够合成荧光色素。菌株为苏氨酸营养缺陷型，可以利用L-缬氨酸、DL-精氨酸和L-苏氨酸作为碳源。 • 3、遗传特性 • DNA中G和C的含量为63%。细胞中携带pVG3质粒，具有硫酸链霉素、盐酸四环素和氨卡青霉素的抗性。 • 4、生产能力 • 具有生产干扰素- a 2b的能力，其放射性免疫学效价不低于2.O×lO9IU/L。

  3. 任务1 菌种库和工作菌种库的建立及保存

  4. 1、菌种库的建立、传代及保存 • 从原始菌种库出发，传代、扩增后，冻干保存，作为主代菌种库(Master cell • bank,MCB)，主代菌种库不得进行选育工作。从主代菌种库传代、扩增后，甘油管保存，作为工作菌种库(Working cell bank,WCB)。工作种子库也可由上一代工作种子库传出，但每次只限传三代。每批主代菌种库均进行划线LB琼脂平板、涂片革兰氏染色、对抗生素的抗性、电镜检查、生化反应、干扰素的表达量、表达的干扰素型别、质粒检查的检定，合格后方可投产。 • 原始菌种库、主菌种库和工作菌种库于-70它以下温度保存。

  5. 2、工作菌种库的建立及保存 • (1)培养基制备。生产过程中使用的培养基均按一定工艺要求配制。 • (2)接种、转移及培养。取12支主代菌种库菌种接大摇瓶内，摇床培养，至 • 吸光值(OD值)为5.5±1.0。将己培养好的摇瓶种子液转移至种子罐中，通人无菌空气，培养至吸光值符合放罐要求(OD值为8.0±2.0)。种子罐培养结束后，无菌操作转移到离心管中，离心l5mmn，加新鲜菌种培养基，将菌体制成菌悬液，并加入甘油使其浓度达到18%，分装于Ependorf管中，每支(1.0±0.2)mL。 • (3)保存。分装完毕，于-2O℃放置16～20h，在-70℃下可保存3年。

  6. 任务2 干扰素发酵工艺过程控制

  7. 一、干扰素发酵工艺过程 • 图3-1干扰素- a 2b发酵工艺流程图

  8. (1)菌种制备 取-7O℃下保存的甘油管菌种 (工作种子批)，于室温下融化。然后，接人摇瓶，培养温度30℃，pH值7.0，250r/min活化培养 (18士2) h后。进行吸光值测定和发酵液杂菌检查。 (2)种子罐培养 将己活化的菌种接入装有 30L培养基的种子罐中，接种量 为 10%，培养温度 30℃，pH值7.0，级联调节通气量和搅拌转速，控制溶 解氧为30%，培养3～4h，当OD值达到4.0以上时，转人到发酵罐中，进行二级放大培养，同时取样进行显微镜检查和LB培养基划线检查，控制杂茵。 （3)发酵罐培养。将种子液通入 300L培养基的发酵罐中，接种量 10%，培养温度30℃，pH值7.0。级联调节通气量和搅拌转速。控制溶解氧为 30%，培养4h。然后控制培养温度20℃，pH值6.0，溶解氧为 60%，继续培养 5～6.5h。同时进行发酵液杂菌检查。当OD值达9.0士1.0后，用 5℃冷却水快速降温至15℃以下，以减缓细胞衰老。或者将发酵液转人收集罐中，加人冰块使温度迅速降至10℃以下。 (4)菌体收集。将己降温至2O℃ 以下的发酵液转人连续流离心机，1600Or/ min离心收集。进行干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性等项目的检测。菌体于-20℃冰柜中保存时。不得超过12个月。每保存 3个月，检查一次活性。

  9. 任务3干扰素的分离纯化工艺过程

  10. 图3-2干扰素- a 2b提取纯化工艺流程图

  11. 1、干扰素分离工艺过程 • (1)菌体裂解。用纯化水配制裂解缓冲液，置于冷室内，降温至2～1O℃。将-2O℃冷冻的菌体破碎成2cm以下的碎块，加人到裂解缓冲液(pH7.0)中，2～1O℃下搅拌2h，利用冰冻复融分散，将细胞完全破裂，释放干扰素蛋白。 • (2)沉淀。向裂解液中加人聚乙烯亚胺。2～1O℃下气动搅拌45min，对菌体碎片进行絮凝。然后，向裂解液中再加入醋酸钙溶液，2～1O。CT气动搅拌l5min。对菌体碎片、DNA等进行沉淀。 • (3)离心。在2～1O℃，将悬浮液在连续流离心机上160OOr/min离心。收集含有目标蛋白质的上清液，细胞壁等杂质沉淀在121℃蒸汽灭菌30min后焚烧处理。 • (4)盐析。将收集的上清液用4mol/L硫酸镀进行盐析，2～1O℃搅匀静置过夜。 • (5)离心与储存。将盐析液在连续流离心机上于1600Or/min离心，沉淀即为粗干扰素，放人聚乙烯瓶中。于4℃冰箱保存(不得超过3个月)。

  12. 2、干扰素纯化工艺过程 (1)配制纯化缓冲液。用超纯水配制纯化缓冲液，配制完毕后经过0.45µm滤器和10ku超滤系统过滤，在百级层流下进行收集。超滤后，将缓冲液送到冷室，冷却至2～10℃。使用前应重新检查缓冲液pH和电导值，准确无误方可使用。 (2)溶解粗干扰素。在2～10℃将粗干扰素倒人匀浆器中，加pH7.5磷酸缓冲液，匀浆，使之完全溶解。 (3)沉淀除杂质。待粗干扰素完全溶解后，用磷酸将溶液调节至pH5.0，进行蛋白质等电点沉淀。 (4)离心。将悬浮液在连续流离心机上于16000r/min离心，收集上清液。 (5)疏水层析。用NaOH调节上清液pH7.0。并用5mol/LNaCl调节溶液电导值180mS/cm，上样，进行疏水层析，利用于扰素的疏水性进行吸附。在2～10℃，用0.025mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)和1.6mol/LNaCl进行冲洗，除去非疏水性蛋白，然后用0.0lmol/L磷酸缓冲液(pH8.0)进行洗脱，收集洗脱液。 (6)沉淀。用磷酸调节洗脱液pH4.5，调节洗脱液的电导值为40mS/cm，搅拌均匀后2～10℃静置过夜(l2h)，进行等电点沉淀。 (7)过滤。将沉淀悬浮液用1000ku的超滤膜进行过滤，在2～10℃进行收集滤液。 (8)透析。调整溶液pH8.0，电导值5.0mS/cm，在l0ku的超滤膜上。2～10℃用0.005mol/L，缓冲液透析。

  13. (9)阴离子交换层析。上样前，先用0. 0lmol/L，磷酸缓冲液(pH8.0)平衡树脂。上样后，用相同缓冲液冲洗，采用盐浓度线性梯度5～50mS/cm进行洗脱，配合SDS-PAGE收集干扰素峰，在2～10℃进行。 (10)浓缩和透析。合并阴离子交换层析洗脱的有效部分，调整溶液pH5.0，电导值5. 0mS/cm，在l0ku超滤膜上，2～10℃下用0. 05mol/L乙酸缓冲液(pH5.0)进行透析。 (11)阳离子交换层析。上样前，先用0.lmol/L乙酸缓冲液(pH5.0)平衡树脂。上样后。用相同缓冲液冲洗。在2～10℃，采用盐浓度线性梯度5～50mS/cm进行洗脱，配合SD茸PAGE收集干扰素峰。 (12)浓缩。合并阳离子交换层忻洗脱的有效部分，在2～10℃，用l0ku超滤膜进行浓缩，浓缩到lL。 (13)凝胶过滤层析。上样前，先用含有0.l5mol/LNaCl的0.0lmol/L磷酸缓\冲液 (pH7.0)清洗系统和树脂，上样后，在2～10℃下，用相同缓冲液进行洗脱。合并干扰素部分，最终蛋白浓度应为0.1～0.2㎎/mL。 (14)无菌过滤分装。用0.22µm滤膜过滤干扰素溶液，分装后，于-20℃ 以下的冰箱中保存。

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