Surveillance microbiologique de l’environnement - les surfaces -

1. Surveillance microbiologique de l’environnement - les surfaces - O. Meunier Service d’Hygiène Hospitalière et de Médecine Préventive - Hôpitaux Universitaires de Strasbourg -

2. Normes NF EN ISO 14698 Salles propres et environnements maîtrisés apparentés Maîtrise de la bio-contamination partie 1 : principes généraux et méthodes partie 2 : évaluation et interprétation des données de biocontamination Description des principes et des méthodes pour maîtriser de la bio-contamination d’un environnement Surveillance cohérente des zones à risque Appliquer des mesures adaptées

3. Maîtrise de la bio-contamination Etablissement du système formalisé • Analyse des risques - points critiques pour leur maîtrise (HACCP) • Arbre de panne (AAP) • Analyse des modes de défaillance et de leurs effets (AMDE)... Permet d’évaluer et de maîtriser les facteurs susceptibles d’avoir une incidence sur la qualité microbiologique du procédé et du produit Définir les niveaux cible, d’alerte et d’action Surveillance de la biocontamination Traitement des échantillons Culture des échantillons

4. Principes de maîtrise de la biocontamination Identifier les dangers potentiels évaluer la probabilité que le danger se produise identifier les mesures préventives définir les zones à risque définir les modalités de prévention établir les limites de la maîtrise établir le plan de surveillance établir les actions correctives en cas de dérive établir les procédures validant la maîtrise former, rédiger.

5. Etablissement du système formalisé Pour chaque zone à risque prendre en compte le risque de contamination air, surfaces, fréquentation... Niveau cible Niveau d’alerte Première alerte en cas de dérive par rapport aux conditions normales nécessite une attention accrue Niveau d’action nécessite une intervention immédiate, recherche de cause, action corrective Adaptés à la zone Accessibles Actualisés

6. Surveillance de la biocontamination Par échantillonnage et dénombrement des unités viables (UV ou UFC) méthode appropriée • Choisie en fonction : • de la zone • des particules viables recherchées • des concentrations attendues • des flores autochtones • accessibilité • méthode • effet du prélèvement sur la zone • précision attendue • efficacité du prélèvement • ...

7. Surveillance de la biocontamination Par échantillonnage et dénombrement des unités viables (UV ou UFC) plan d’échantillonnage • à chaque dépassement de seuil • après arrêt prolongé des activités • après les opérations de maintenance • à chaque modification de procédé de production, de nettoyage, de désinfection… • après des évènements inopinés pouvant contribuer à la bio-contamination • En activité maximale et au repos • Initial et actualisé • choisir les sites en fonction de l’emplacement et de la fonction • nombre • fréquence • méthodes • volumes ou surfaces • neutralisants • évènements interférants...

8. Traitement des échantillons Prélèvement, transport, traitement ne doivent pas affecter ni la viabilité, ni le nombre des microorganismes prélevés. Milieux de culture et incubation choisis selon le type de microorganismes recherchés • Milieux de culture non sélectifs • additifs appropriés (inhibiteurs) • Incubation appropriée • 2 à 5 jours pour les bactéries • 5 à 7 jours pour les champignons • conditions atmosphériques compatibles Aucune précision sur la qualité du milieu !

9. Evaluations des données d’échantillonnage Doit permettre d’engager des actions correctives efficaces Intérêt du dénombrement Intérêt de l’identification A définir A évaluer L’interprétation se fera surtout sur la base de l’historique des résultats obtenues dans la zone, sur le site...

10. Expression des résultats • Unités Viables (UV) ou Unités Formant Colonie (UFC) • Le rapport d’essai doit comporter : • type d’échantillon • la méthode (numéro ou titre de la norme) • le dispositif de prélèvement employé • le site d’échantillonnage • le type d’activité en cours, l’état d ’occupation • le nombre de personnes présentes • la date et l’heure, la durée du prélèvement • la date d’examen des échantillons • les conditions et durée d’incubation • les modifications de méthode • les résultats (numération et/ou identification) • le nom de l’organisme chargé du rapport d’essai • le nom et la signature du responsable des essais.

11. Modalités des prélèvements bactériologiques de surfaces Effectuer des stries parallèles rapprochées sur la surface définie - tout en tournant l’écouvillon - Répéter le prélèvement sur la même surface en effectuant les stries dans le sens perpendiculaire au précédent remettre l’écouvillon dans un volume défini de liquide pour la numération la surface est nettoyée afin d’éliminer tout résidu nutritif Ecouvillons humidifié non standardisé toutes les surfaces

12. Modalités des prélèvements bactériologiques de surfaces Surface étudiée de 20 cm2 pression uniforme de quelques secondes sans mouvement circulaire ou linéaire la surface est nettoyée afin d’éliminer tout résidu nutritif Empreintes gélosées standardisé : 500 g pdt 10 s ou 200 g pdt 2 min ou applicateur Count-Tact (25 g/cm2 +/- 10% pdt 10 s) surfaces planes

13. Modalités des prélèvements bactériologiques de surfaces Calcul du rendement d’extraction par souche et par type de surface ! 8 à 10 prélèvements successifs sur la même zone - numération plus de 3 analyses calcul des moyennes Si l’on admet que la méthode à un rendement constant dans des conditions données. Le nombre de bactéries détachées varie logarithmiquement. L’équation de la cinétique de détachement est logNi = log a + i log b

14. Ni log A B C D E F 523 2.72 1 380 416 460 584 680 620 191 2.28 2 263 93 147 201 193 249 105 2.02 3 183 62 53 124 78 129 59 1.77 4 102 35 45 40 54 80 37 1.57 5 70 10 22 43 31 46 27 1.43 6 38 13 11 53 15 33 9.5 0.98 7 15 7 0 21 5 10 3.2 0.5 8 6 0 0 9 1 3 Modalités des prélèvements bactériologiques de surfaces Calcul du rendement d’extraction par souche et par type de surface ! Ni = nbre de germe par unité de surface pour le prélèvement de rang i i = rang du prélèvement log a = ordonnée à l ’origine log b = coefficient angulaire de la droite logNi = log a + i log b Log b = -0.29 Pour E. coli sur du PVC Log Ni Rang de prélèvement NT = N1/(1-b) b = 0.52 NT = 523 /(1 - 0.52) = 1090

15. Ni log A B C D E F 523 2.72 1 380 416 460 584 680 620 191 2.28 2 263 93 147 201 193 249 105 2.02 3 183 62 53 124 78 129 59 1.77 4 102 35 45 40 54 80 37 1.57 5 70 10 22 43 31 46 27 1.43 6 38 13 11 53 15 33 9.5 0.98 7 15 7 0 21 5 10 3.2 0.5 8 6 0 0 9 1 3 Modalités des prélèvements bactériologiques de surfaces Calcul du rendement d’extraction par souche et par type de surface ! Ni = nbre de germe par unité de surface pour le prélèvement de rang i i = rang du prélèvement log a = ordonée à l ’origine log b = coefficient angulaire de la droite logNi = log a + i log b R = N1/NTx100 Pour E. coli sur du PVC N1 = 523 NT = 1090 R = 48 % Inox X2 carrelage X2 PVC X5 bois X10

16. Modalités des prélèvements bactériologiques de surfaces Attention Grandes variations des résultats en fonction des couples bactérie / support testés étudiés inox PVC Très bonne adhésion sur l’inox E. coli 48 % 28 % S. aureus 37 % 21 %

17. Calcul du rendement d’extractiondes empreintes géloséespour le contrôle microbiologique des textiles 1. Préparation d’une suspension de Staphylococcus aureus ATCC 29213 à 105 UFC/ml dans de l’eau distillée stérile (EDS) 2. Contamination artificielle d’échantillons de textile tissé (polyester-coton) stérile, carré de 3 cm de côté, suivi d’un séchage sous flux laminaire 50l de suspension à 105 UFC/ml 50l d’EDS (témoin négatif) 3. Sur chaque échantillon de tissu (n=5) 10 prélèvements successifs sont réalisés à l’aide de boîtes Rodaccontenant un milieu TCSA additionné de lécithine et de polysorbate poids de 200g appliqué pendant 2min boîte Rodac échantillon de tissu boîte de Pétri stérile 4. Incubation à 37°C pendant 24h puis dénombrement des colonies

18. 1. Préparation d’une suspension de S. aureus ATCC 29213 à 105 UFC/ml dans de l’eau distillée stérile Alternative à la techniquedes empreintes géloséespour le contrôle microbiologique des textiles 2. Contamination artificielle d’échantillons de textile tissé (polyester-coton) stérile, carré de 3 cm de côté, suivi d’un séchage sous flux laminaire 50l de suspension à 105 UFC/ml 50l d’eau distillée stérile (témoin négatif) 3. Chaque échantillon (n=3) est placé dans un Erlen avec 10 ml d’eau distillée stérile (EDS) 10mL d’EDS 4. Sonication (12 min à 35 kHz) pour chaque échantillon, 6 extractions successives sont réalisées 4. Dénombrement des bactéries libérées du tissu à partir des suspensions obtenues à la fin de chaque extraction (sur milieu TCSA additionné de lécithine et de polysorbate).

19. Modalités des prélèvements bactériologiques de surfaces avec neutralisants lecithine polysorbate 80 thiosulfate de sodium L-histidine • Empreintes gélosées • Ecouvillonnage, frottis • Brossage, lavage-récupération • Aspiration récupération • Bioluminescence (ATPmétrie) technique recommandée par le CDC

20. Limites • Eléments d’appréciation qualitatifs • Faible surface investiguée • contamination très variable d’un site à l’autre • conditions de survie variables (biofilm, matière organique) • Microorganismes « stressés » • Attention au taux de récupération ou rendement de la technique • fonction de la technique • de la surface • de l’espèce bactérienne recherchée

21. Limites • Choix des milieux Milieux riches, milieux pauvres ? PCA ou PCSA ou PSA Gélose au sang de mouton Milieux sélectifs Bouillon thioglycolate pour les germes anaérobies Bouillon trypcase soja pour les germes aérobies Gélose count tact Biomérieux biotrypcase 15 g biosoyase 5 g NaCl 5 g agar 20.5 eau pH 7 + inhibiteurs Alginate, dissolution dans le bouillon + inhibiteurs +/- radiostérilisé

22. Limites • Les inhibiteurs Chlorhexidine Lecithine 0.7g/l Polysorbate 80 (tween 80) 5 g/l L Histidine 1g/l Thiosulfate 0.5 g/l Phénols, aldéhydes Ammonium quaternaire Dérivés mercuriels et hexochlorophène Halogénés Tester l’efficacité des inhibiteurs

23. Interprétation Industrie alimentaire < 1 / cm2 excellent 2 à 10 / cm2 bon 11 à 100 / cm2 surface à nettoyer > 100 / cm2 arrêter la chaîne de production Satisfaisant < 10 0 abs Acceptable 11 à 100 1 à 10 abs non satisfaisant > 100 > 10 présence Flore totale / 10 cm2 Coliformes totaux / 10 cm2 Listeria

24. Interprétation Industrie alimentaire < 1 / cm2 excellent 2 à 10 / cm2 bon 11 à 100 / cm2 surface à nettoyer > 100 / cm2 arrêter la chaîne de production Zones à risques infectieux à l’hôpital risque UFC/25cm2 UFC/100cm2 4 < 5 < 10 3 < 5 < 100 2 < 50 < 1000 1 < 125 > 1000 Recommandation française Projet de norme européenne

25. Interprétation Zones à hauts risques infectieux UFC/boite niveau d’action 25 niveau d’alerte 10 niveau cible 5 Aspec hors présence humaine + ou - 10 en présence humaine Zones à très hauts risques infectieux UFC/boite niveau d’action 10 niveau d’alerte 5 niveau cible < 1

26. Interprétation Faire des plans d’échantillonnage fonction des indications épidémie contrôle bactéries ou champignons pendant l’activité, après l’activité… Fréquence des prélèvements dépend aussi des indications Importance majeure de la comparaison des résultats entre eux, sur le long terme, avec la même méthode, même technicien… Définition de ses propres seuils sur la base de l’historique des résultats

27. À l’Hôpital

28. INFECTIONS NOSOCOMIALES ENVIRONNEMENT Eau Air Surfaces Réservoir de microorganismes ? Infections nosocomiales ? pour les autres microorganismes Hypothétique non démontré Olivier Meunier / Institut d’Hygiène / oct 2002 OUI pour - Aspergillus - Legionella - Mycobactéries - Pseudomonas...

29. Infections nosocomiales Environnement AIR possibles Aspergillus fumigatus Legionella pneumophila EAU probables ? Pseudomonas aeruginosa Stenotrophomonas maltophilia SURFACES sans preuve Les surfaces peuvent elles constituer des réservoirs microbiens à l’origine de la contamination ?

30. Difficulté d’établir une relation de causalité entre le réservoir environnemental et la survenue d’infections nosocomiales Immensité du réservoir Analyse exhaustive impossible Représentativité de l’échantillonnage ? Modalités techniques Coût des analyses Inoculum suffisant Virulence Porte d’entrée Mode de contamination Réceptivité du patient infection colonisation Nombreuses étapes

31. INFECTIONS NOSOCOMIALES ENVIRONNEMENT Hypothétique non démontré Olivier Meunier / Institut d’Hygiène / oct 2002 épidémies Recherche d’un réservoir environnemental - Résultats positif - Comparaisons phénotypique et génotypique À l’origine du ou des cas ? ou Reflet de la présence du ou des cas ?

32. INFECTIONS NOSOCOMIALES ENVIRONNEMENT Olivier Meunier / Institut d’Hygiène / oct 2002 La maîtrise de l’environnement semble néanmoins indispensable à l’hôpital et nécessite un contrôle - Contrôle dans le cadre d ’une qualification d ’installation bloc opératoire, flux, circuits de dialyse… - Contrôle de surveillance maintenance, après travaux, définition des seuils - Contrôle d ’investigation recherche d ’un réservoir à l ’origine de cas - Contrôle à titre pédagogique visualisation sur les mains

33. INFECTIONS NOSOCOMIALES ENVIRONNEMENT Olivier Meunier / Institut d’Hygiène / oct 2002 Limites aux contrôles Attention aux techniques de prélèvement limites, reproductibilité, standardisation... Définir des seuils - cible - alerte - action Les contrôles ne sont pas - des prévisions de risque infectieux - des certificats de conformité - des certificats de bonne ou mauvaise conduite - des certificats de bonne conscience

34. Environnement Réservoir microbien Grande diversité Bactéries : flore environnementale (Bacillus sp, Acinetobacter sp, Staphylococcus sp) flore humaine saprophyte (S. hominis, S. epidermidis, Acinetobacter baumannii…) flore humaine opportuniste (Pantoea agglomerans, Pseudomonas sp, S. maltophilia) flore humaine pathogène Virus Champignons : survie des levures (Rhodotorula, Candida sp) champignons filamenteux (grande variété, fréquence d’A. fumigatus) Parasites : Cryptosporidium parvum kystes d’amibes Giardia intestinalis Cyclospora microsporidies ATNC

35. Oreillons Rubéole Herpes CMV Adenovirus Adenovirus minutes Hépatite A VRS B. pertussis Rotavirus Rotavirus heures H. influenzae N. meningitidis jours S. pneumoniae semaines Acinetobacter Staphylococcus Staphylococcus Survie dans l’environnement Influenzae VRS Hépatite B M. tuberculosis

36. Nettoyage et désinfection des surfaces Bionettoyage Détergent-désinfectant : Réduction d’un log10 le nombre de bactéries sur une surface nettoyée Nettoyeur vapeur : Réduction d’un log10 Si l’on traite moins de 8 m2 en 2 minutes

37. RINCER NETTOYER DESINFECTER détergent eau Désinfectant NETTOYER - DESINFECTER RINCER Détergent-Désinfectant eau Comment désinfecter ? « On ne désinfecte que ce qui est propre » O. Meunier / Institut d’Hygiène / 2003

38. Désinfectant alcool à 70° Adénovirus Rotavirus formes végétatives VHB Spores bactériennes 0,5°Chl 1,2°Chl 3 à 6°Chl Eau de Javel Comment désinfecter ? Détergent savon, produit vaisselle... Détergent-Désinfectant Réservé à l’usage alimentaire O. Meunier / Institut d’Hygiène / 2003

39. Chiffonnette imprégnée Temps de contact de 15 minutes avant le rinçage Immersion Temps de contact de 15 minutes avant le rinçage Comment désinfecter ? Le séchage est recommandé O. Meunier / Institut d’Hygiène / 2003

40. Indications des prélèvements bactériologiques de surfaces • Contrôle de la qualité des procédures de bio-nettoyage • Respect des procédures • Recherche d’un réservoir à l’origine de cas groupés Pseudomonas aeruginosa Objet de bain contaminé en pouponnière Bain marie dans un service de greffe surfaces / erreur d’utilisation des détergents et dD Alcaligenes (Achromobacter) xylosoxidans Pantoea agglomerans Stenotrophomonas maltophilia • Visualisation de la qualité microbiologique de l’environnement But pédagogique

41. Gélose au sang Milieu TCSA Récupérer les bactéries à partir des surfaces bactéries « stressées » Milieux riches ou milieux pauvres ? peptone 23 amidon 1 NaCl 5 Agar 18 sang de mouton peptone de caséine 15 peptone de soja 5 NaCl 5 Agar 18 Autres milieux « pauvres » : PCA, R2A, TGA...

42. enrichissement Récupérer les bactéries à partir des surfaces bactéries « stressées » Enrichissement ou non ? 18 à 24 h à 37°C bouillon nutritif amplification pas de quantification

43. Gélose au sang Milieu TCSA Gélose au sang enrichissement Milieu TCSA 360 prélèvements Nombre d’espèces différentes : 718 Entérobactéries P. aeruginosa Staphylococcus sp 78 (10.8 %) 96 (13.4 %) 496 (69.1 %) 650 (90.5.6 %) 718 12 (15 %) 11 (13.8 %) 71 (89 %) 79 (98.8 %) 80 17 (30.4 %) 20 (35.7 %) 42 (75.0 %) 55 (98.2 %) 56 29 (11.7 %) 45 (18.2 %) 136 (55.1 %) 247 (100 %) 247

44. Exemples de réponse Interprétation et expression des résultats Staphylococcus epidermidis est un microorganisme de la flore cutanée humaine dispersé dans l’environnement par les mains. Nous avons montré que les souches isolées à proximité des malades sont très souvent méticillino-résistantes (60 %) et nous pensons que l’environnement peut jouer le rôle de réservoir secondaire à l’origine de la contamination des malades. Staphylococcus aureus est une bactérie de la flore humaine dispersée dans l’environnement par les mains. Elle est responsable de près de 20 % des infections nosocomiales.

45. Exemples de réponse Interprétation et expression des résultats Acinetobacter baumannii est une bactérie de la flore cutanée humaine normale. Elle est de plus en plus souvent responsable d’infections nosocomiales. A l’hôpital, Acinetobacter baumannii est volontiers résistant aux antibiotiques (58 % expriment une céphalosporinase). Enterococcus, Streptocoque D, Enterobacter,... Sont des bactéries de la flore fécale humaine dont la dispersion dans l’environnement est manuportée. Ces bactéries sont fréquemment impliquées dans les infections nosocomiales.

46. Exemples de réponse Interprétation et expression des résultats Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia... Sont des bactéries de la flore hydrique, colonisants les points d’eau et toutes les zones humides. Une décolonisation des siphons peut être effectuée régulièrement par 100 ml d’eau de Javel par exemple. Toutes ces bactéries doivent être éliminées des surfaces à proximité des malades par un nettoyage régulier et soigneux : S… à 0,25 %. Le lavage des mains très régulièrement permet d ’éviter la dispersion des microorganismes.

47. Résultats d’étude 1 DIVERSITE DES ESPECES BACTERIENNES DANS LES PRELEVEMENTS DE L’ENVIRONNEMENT A L’HOPITAL Roggy S., Winum A., Freyd A., Bientz M., O.Meunier Institut d’Hygiène, Faculté de Médecine, Strasbourg

48. DIVERSITE DES ESPECES BACTERIENNES DANS LES PRELEVEMENTS DE L’ENVIRONNEMENT A L’HOPITAL Bacillus cereus 10/53 B. licheniformis 9/53 B. pumilus 4/53 B. lentus 2/53 B. circulans 1/53 B. brevis 1/53 B. sphaericus 1/53 B. subtilis 1/53 Paenibacillus pabulis 1/53 non identifié 12/53 Enterococcus faecalis 50% Enterococcus sp non faecalis

49. SALLE DE SOIN (loin du malade) CHAMBRE (près du malade) près de l’eau loin de l’eau près de l’eau loin de l’eau A B C D

50. C D A B C DIVERSITE DES ESPECES BACTERIENNES DANS LES PRELEVEMENTS DE L’ENVIRONNEMENT A L’HOPITAL A B C D Staphylococcus epidermidis 49/109 4 5 2 38 S. hominis 18/109 1 6 1 10 S. warneri 14/109 2 1 11 S. haemolyticus 13/109 3 1 9