Download
1 / 17
170 likes | 302 Views
Βιολογικός ρόλος της Απολιποπρωτεΐνης J/Clusterin σε ανθρώπινα καρκινικά ηπατικά και παγκρεατικά κύτταρα. Άννα Γιοράν. Τομέας Βιολογίας Κυττάρου & Βιοφυσικής, Τμήμα Βιολογίας, Εθνικό & Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών, Πανεπιστημιούπολη, Ζωγράφου, 15784, Αθήνα
E N D
Βιολογικός ρόλος της Απολιποπρωτεΐνης J/Clusterin σε ανθρώπινα καρκινικά ηπατικά και παγκρεατικά κύτταρα. Άννα Γιοράν Τομέας Βιολογίας Κυττάρου & Βιοφυσικής, Τμήμα Βιολογίας, Εθνικό & Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών, Πανεπιστημιούπολη, Ζωγράφου, 15784, Αθήνα Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών, Ινστιτούτο Βιολογικών Ερευνών & Βιοτεχνολογίας, Βασ. Κων/νου 48, 11635, Αθήνα
Εισαγωγή H ανθρώπινη Apolipoprotein J/Clusterin (CLU) είναι μια εκκρινόμενη ετεροδιμερής γλυκοπρωτεΐνη ~ 75-80 kDa η οποία εκφράζεται σχεδόν σε όλους τους ανθρώπινους ιστούς και βρίσκεται σε σχετικά μεγάλη συγκέντρωση σε όλα τα βιολογικά υγρά του ανθρώπου. Στο αίμα η CLU δρα κυρίως ως Απολιποπρωτεΐνη και εντοπίζεται στα HDL κυστίδια.Εμφανίζει επίσης δράση μοριακής συνοδού (molecular chaperon). Έχει προταθεί ότι η sCLU εμπλέκεται λειτουργικά σε μοριακές διαδικασίες: • Ανάπτυξης • Διαφοροποίησης • Γήρανσης • Αθηροσκλήρωσης • Διαβήτη • Νευροεκφυλιστικών νόσων • Καρκινογένεσης
Εισαγωγή ΚΑΡΚΙΝΟΣ ΤΟΥ ΗΠΑΤΟΣ Ο καρκίνος του ήπατος είναι η έκτη συχνότερη κακοήθεια και η τρίτη συχνότερη αιτία θανάτου λόγω καρκίνου, παγκοσμίως. Το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα είναι η πιο συνήθης πρωτοπαθής κακοήθεια του ήπατος στους ενήλικες.
Εισαγωγή ΚΑΡΚΙΝΟΣ ΤΟΥ ΠΑΓΚΡΕΑΤΟΣ Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι ο 13ος πιο συχνός τύπος καρκίνου σε παγκόσμιο επίπεδο. Αρκετά συχνά έχει κακή πρόγνωση, γεγονός που τον καθιστά την 8η πιο συχνή αιτία θανάτου λόγω καρκίνου.
Σκοπόςτηςμελέτης... ...είναι η διερεύνηση του λειτουργικού ρόλου της CLU σε ανθρώπινα καρκινικά ηπατικά και παγκρεατικά κύτταρα και η καταγραφή των επαγώμενων φαινοτύπων είτε λόγω γονιδιακής υπερέκφρασης (μέθοδος διαγονιδίου - transgene) είτε μέσω επίτευξης γονιδιακής σιγής (μέθοδος μικρών RNAs παρεμβολής - siRNA) για το γονίδιο της CLU. Ιδιαίτερη έμφαση δίνεται στηλειτουργική σχέση της sCLU με το σηματοδοτικό μονοπάτι INS/IGF-1.
Υλικά & Μέθοδοι • Ανθρώπινες ηπατικές (HepG2 και Huh-7) και παγκρεατικές (Panc1) καρκινικές κυτταρικές σειρές. HepG2 Huh-7 Panc1 • Γονιδιακή υπερέκφραση CLU specific siRNA oligonucleotide • Γονιδιακή σιγή • Ποσοτικό RT-PCR • Ανοσοστύπωμα
Αποτελέσματα • Σύγκριση των ενδογενών επιπέδων έκφρασης της CLU μεταξύ των ηπατικών κυτταρικών σειρών. HepG2 Huh7 86 kDa psCLU 47 kDa sCLU 34 kDa 47 kDa GAPDH • Σύγκριση του πολλαπλασιαστικού δυναμικού των κυτταρικών σειρών Huh7 και ΗepG2.
Αποτελέσματα • Απομόνωση κλωνοποιημένου πλασμιδίου από μετασχηματισμένα βακτήρια. Πέψεις με περιοριστικές ενδονουκλεάσες. • Επιμόλυνση των κυτταρικών σειρών Huh7, HepG2 και Panc1 με το ανθρώπινο γονίδιο της CLU. Vector-48h CLU-48h Mock-24h Mock-48h Vector-24h CLU-24h psCLU Huh7 sCLU GAPDH psCLU HepG2 sCLU GAPDH psCLU Panc1 GAPDH Αναμενόμενες ζώνες: BamHI: 1567 bp, 5.5 kb EcoRI: 705 bp, 872 bp, 5.5 kb
Αποτελέσματα • Έλεγχος της επίδρασης της υπερέκφρασης της CLU στο πολλαπλασιαστικό δυναμικό των κυττάρων Huh7, HepG2 και Panc1.
Αποτελέσματα • Επιμόλυνση των κυτταρικών σειρών Huh7, HepG2 και Panc1 με sCLU-ειδικά siRNAs για τη μερική σίγηση της έκφρασης του γονιδίου CLU. • Έλεγχος της επίδρασης της μερικής σίγησης του γονιδίου της CLU στο πολλαπλασιαστικό δυναμικό των κυττάρων. Scramble Scramble siRNA siRNA Mock Mock 48h 72h CLU Huh7 GAPDH HepG2 CLU GAPDH Scramble siRNA Mock 72h CLU Panc1 GAPDH
Αποτελέσματα • Έλεγχος της επίδρασης της υπερέκφρασης της CLU στην έκφραση γονιδίων που συμμετέχουν στο σηματοδοτκό μονοπάτι INS/IGF-1. • Έλεγχος με RT-PCR. • Έλεγχος με ανοσοστύπωμα κατά Western. Mock-24h Vector-24h Vector-48h Mock-48h CLU-24h CLU-48h Huh7 ERK-1 Vector-48h p-Akt Mock-48h Vector-24h Mock-24h CLU-48h CLU-24h HepG2 Akt GAPDH ERK-1 mTOR p-Akt SOS1 Akt GAPDH GAPDH mTOR Mock-24h Vector-48h Mock-48h Vector-24h CLU-48h CLU-24h SOS1 Panc1 GAPDH ERK-1 GAPDH p-ERK mTOR p-mTOR SOS1 GAPDH
Αποτελέσματα • Έλεγχος της επίδρασης της μερικής σίγησης της CLU στα επίπεδα έκφρασης πρωτεϊνών που συμμετέχουν στο σηματοδοτικό μονοπάτι INS/IGF-1. • Έλεγχος με ανοσοστύπωμα κατά Western. • Έλεγχος με RT-PCR. Scramble Mock siRNA Scramble Mock siRNA HepG2 Huh7 Panc1 ERK-1 ERK-1 GAPDH GAPDH Akt Akt GAPDH GAPDH mTOR mTOR SOS1 SOS1 GAPDH GAPDH siRNA Mock Scramble Panc1 ERK-1 Akt GAPDH p-ERK p-Akt mTOR GAPDH p-mTOR GAPDH
Αποτελέσματα • Έλεγχος με ανοσοστύπωμα κατά Western / ποσοτικοποίηση ζωνών. Υπερέκφραση sCLU Σίγηση sCLU HepG2 Huh7 Panc1 Panc1
Αποτελέσματα • Έλεγχος επίδρασης του χημειοθεραπευτικού φαρμάκου Doxorubicin (DXR) στο πολλαπλασιαστικό δυναμικό των κυττάρων και στην επαγωγή κυτταρικού θανάτου.
Συμπεράσματα • Τα ενδογενώς υψηλά επίπεδα έκφρασης της CLU σε καρκινικά κύτταρα ενδεχομένως συμβάλλουν σε μείωση του πολλαπλασιαστικού δυναμικού και στην εμφάνιση χημειοανθεκτικότητας. • Εξωγενώς επαγώμενη υπερέκφραση της CLU μειώνει το πολλαπλασιαστικό δυναμικό ηπατικών και παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων. • Μείωση των επιπέδων έκφρασης της CLU αυξάνει το ρυθμό αύξησης ηπατικών και παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων. • Ενδεχομένως οι αλλαγές στην έκφραση της CLU να επηρεάζουν τα επίπεδα έκφρασης τουγονιδίου mTOR. • Σύμφωνα με τα προκαταρκτικά πειράματα μας, τα επίπεδα έκφρασης της CLU δεν φαίνεται να επηρεάζουν άμεσα το μονοπάτι σηματοδότησης INS/IGF-1.
Ευχαριστίες... ΕΚΠΑ, Τμήμα Βιολογίας: Ιωάννης Π. Τρουγκάκος(επιβλέπων) Λουκάς Χ. Μαργαρίτης Ιωάννης Γρίβας Ελένη Τσακίρη Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών: Ευστάθιος Σ. Γκόνος Νίκη Χονδρογιάννη Επιστημονικό προσωπικό του Προγράμματος Μοριακής και Κυτταρικής Γήρανσης
